[发明专利]一种提高猪克隆胚胎发育效率的方法

说明书

本发明涉及动物克隆方法领域，具体涉及一种提高猪克隆胚胎发育效率的方法。本发明方法主要包括在猪克隆胚胎的基础培养液中添加母猪的子宫液。本发明方法显著提高了克隆胚胎早期发育的囊胚率和囊胚内总细胞数。通过早期胚胎的转录组测序结果显示添加母猪子宫液培养使克隆胚胎与正常体内受精胚胎之间的差异表达基因数目减少。最为重要的是，通过添加母猪子宫液还提高了克隆胚胎的受体母猪的分娩率和窝均活仔数，表明本发明方法有效地提高了克隆胚胎体内发育的最终效率。

技术领域

本发明涉及动物克隆方法领域，具体涉及一种提高猪克隆胚胎发育效率的方法。

背景技术

哺乳动物体细胞核移植技术是一项在农业和再生医学领域应用前景广泛的新技术，如2000年，Polejaeva等人首次报道了运用成体体细胞核移植制备出克隆猪；2004年，LaiPrather公开了猪体细胞核移植技术的操作流程。自从世界首例体细胞克隆哺乳动物“Dolly”羊诞生以来，大量动物已经被成功克隆，体细胞核移植技术作为一种新的辅助生殖技术，在农业生产、生物医学和生物学基础研究等领域都有重要的应用价值，但体细胞克隆胚胎全期发育效率(出生克隆后代数/重构克隆胚胎数)远低于自然受精胚胎，过低的发育效率是目前阻碍该项技术应用主要的制约因素。目前，猪的克隆胚胎全期发育效率只有约0.5-1％，出生的克隆猪经常出现各种器官的发育异常，很难在正常饲养条件下生存下去。

体细胞核移植技术是目前唯一能够将已分化的体细胞重编程为具有全能性的胚胎，并且能够发育成动物个体的辅助生殖技术。影响该技术效率的因素包括供核细胞类型、受体卵母细胞的质量、核移植操作的方法和胚胎体外培养体系等。目前猪的克隆研究主要是应用于转基因猪制备和优秀种公猪的复制扩繁上，其中在转基因克隆中常用的是猪胎儿成纤维细胞作为供核细胞，而优秀种公猪的克隆则通常用皮肤成纤维细胞。猪卵母细胞体外成熟的效率已较高，一般能超过80％。核移植操作流程中的各个技术环节方法已趋于标准化。

克隆胚胎的培养体系对于其正常生长代谢至关重要，优化猪的克隆胚胎体外培养体系一直是改善体细胞克隆胚胎发育效率的一个研究热点。包括对基础培养液，表观遗传修饰剂、生长因子、氨基酸和维生素等添加剂和氧分压等的探索，为建立稳定的猪克隆胚胎的最佳培养体系打下了良好的基础。

由于猪胚胎内含有大量的脂滴，对温度非常敏感，所以猪的胚胎是比较难于进行体外操作和培养的。目前使用广泛的猪胚胎基础培养液为NCSU23和PZM3两种，其主要成分均包括水、离子、能量物质、氨基酸、蛋白质及缓冲系统等，在猪的孤雌胚胎的早期培养能达到50％左右的囊胚率。为了寻找能够促进供核细胞染色质结构变得更利于重编程，擦除体细胞的表观遗传修饰标记和表观记忆，已有大量研究在克隆胚胎培养液中添加不同的DNA甲基化酶抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂等表观遗传修饰小分子物质，如5-氮杂-2'-脱氧胞苷、曲古抑菌素、丙戊酸和维生素C，在促进克隆胚胎早期体外发育方面已有较好进展。虽然这十几年来，猪克隆操作流程和体外培养体系等均有所改进，但克隆效率并没有得到大幅度提升。至今困扰该项技术应用的最大因素仍在于克隆胚胎发育效率很低。

发明内容

鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种提高猪克隆胚胎发育效率的方法。

本发明采用以下技术方案：

一种提高猪克隆胚胎发育效率的方法，包括在猪克隆胚胎的基础培养液中添加母猪的子宫液。

进一步的，所述方法中可采用所有品种的母猪的子宫液。

优选地，猪克隆胚胎的基础培养液是PZM3或NCSU23培养液。

进一步的，所述母猪的子宫液可选用在母猪鉴定为发情后第1-10天中任意时期采集的子宫液。

优选地，所述母猪的子宫液选为母猪鉴定为发情后第3-10天中任意时期采集的子宫液。

优选地，用于采集子宫液的母猪年龄为8-36月龄。