[发明专利]一种芦笋茎枯病菌LAMP检测引物组及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种芦笋茎枯病菌LAMP检测引物组及其检测方法，专用于芦笋茎枯病菌的快速分子检测，同时可实现田间芦笋茎枯病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定、防治及生物技术领域。

背景技术

芦笋富含皂苷、固醇、黄酮甙、异黄酮、含硫氨基酸、组蛋白、核酸和酶类大分子、维生素C、维生素E、 B 族维生素、芦丁、叶酸、糖类免疫的激活剂以及人类健康必要的锰、锌、铜、铁等微量矿物质，营养价值极高，是一种名贵的保健蔬菜，其嫩茎风味鲜美，细嫩可口，具有很高的食用和药用价值，已成为深受消费者喜爱的营养保健型高档蔬菜，国际上享有“蔬菜之王”的美誉，风靡欧洲、美洲、韩国、日本等国，也成为我国出口创汇的特色蔬菜之一。芦笋是多年生宿根的草本植物，春、秋季抽出的嫩芽即为可食用的“芦笋”。芦笋是一种名贵的中药材，古代《神农本草经》称它为“上品之上”，《本草纲目》称其能“解诸瘤之毒”。据科学研究表明，芦笋富含组织蛋白质，人体所需的17种氨基酸，而以天门冬氨含量高达51.32mg/100ml，维生素中以维生素A含量尤为丰富，多种微量元素以硒的含量较为突出，所有这些特殊物质都能抑制癌细胞的产生。

芦笋茎枯病是芦笋上一种毁灭性病害，由拟茎点霉[Phomopsis asparagi(Sacc.) Bubak]引起，茎枯病的发生需要湿热气候条件，欧美芦笋主产区均为冷凉气候，故在欧美国家基本不发生茎枯病。在我国芦笋种植地区芦笋茎枯病每年均有不同程度的发生，我国南方芦笋种植区，茎枯病发生更严重，一旦发病当年就会造成20%-50%的损失，如果防治不力，次年就可能造成绝收毁园，给芦笋生产造成极大威胁。芦笋茎枯病菌在田间主要通过风雨传播，雨水飞溅是近距离传播的主要因子，而种子带菌、带菌鲜笋调运是远距离传播的主要因子，而病害初发期是病害防治的最佳时期。因此，建立一种简便、快速、灵敏的检测方法用于芦笋茎枯病的早期诊断，为病害的最佳防治时期提供技术支撑，同时防治病害从病区向非病区传播具有重要意义。

芦笋茎枯病可为害芦笋茎秆、枝条、小枝和拟叶，为害芦笋茎秆和枝条初期出现水渍状斑点，后逐渐扩大成梭形或椭圆形的病斑。干燥条件下病斑边缘清晰，扩展较慢，高温潮湿时病斑扩展迅速，深入茎秆髓部，造成茎秆枯死。为害拟叶和小枝，先出现褐色小点，而后迅速扩大，形成边缘紫红色，中间灰白色的拟叶病段，使拟叶迅速枯死。芦笋茎枯病为害茎秆，尤其是为害茎秆基部的病害症状与芦笋枯萎病相似，而为害拟叶和小枝的病害症状与芦笋褐斑病相似，给芦笋茎枯病的诊断造成很大难度。以症状为基础的病害常规诊断技术耗时长、效率低、准确性差，难以满足芦笋茎枯病诊断的实际需要，因此迫切需要建立一套方便快捷、结果可靠、灵敏度高的快速诊断技术。

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）技术是由日本科学家Notomi等开发的一种简便、快速、准确、高效的核酸恒温扩增方法。该技术在等温条件下短时间内实现大量扩增，30 min -60 min内实现10⁹-10¹⁰倍的扩增，具有很高的灵敏性和特异性，且操作简便，检测结果可肉眼判断。相比不同的PCR技术，LAMP技术全程恒温反应，无需PCR仪，且扩增量大灵敏度高。目前LAMP检测已成功应用于人畜病原物、食品安全、环境安全及多种植物病原物检测的报道，但目前有关芦笋茎枯病菌LAMP检测的研究尚未见报道。

发明内容

针对现有技术中对芦笋茎枯病菌的检测和鉴定程序繁琐、耗时长、对鉴定经验要求高、准确度低，PCR检测需要依靠扩增仪等设备的问题，提供了一种芦笋茎枯病菌LAMP检测引物组及简便、快捷、灵敏、特异的可视化检测方法。

为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：

1.芦笋茎枯病菌LAMP检测引物的设计

根据芦笋茎枯病菌核糖体内转录间隔区（rDNA-ITS）序列在真菌种内的高度保守性和科属种间可变性的特点设计对芦笋茎枯病菌具有特异扩增作用的LAMP检测引物组，包括2条外引物（F3和B3）和2条内引物（FIP和BIP），其核苷酸序列分别为：

F3：5’-ACATTGCGCCCTCTGGTAT-3’；

B3：5’-CCTACCTGATCCGAGGTCAA-3’；

FIP: 5’-GAAAGCAGTGCCCCAACACCA-CATGCCTGTTCGAGCGTC-3’；