[发明专利]基于荧光定量PCR检测银鲳的引物和探针及其试剂盒与方法

说明书

本发明公开了一种基于定量PCR技术快速鉴别银鲳的检测引物和探针，以及采用了该引物和探针的检测试剂盒和检测方法。检测引物组包括上游引物FP、下游引物BP和探针；检测试剂盒包括引物液、PCR MIX反应液、去离子水、阴性对照和阳性对照。其检测方法是通过提取待检样品DNA，利用荧光定量PCR技术对待检样品DNA进行快速检测，通过实时扩增曲线判断待检样品是否为银鲳。本发明具有快速、灵敏、特异、易操作等优点，适于推广应用等优点。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种基于荧光定量PCR检测银鲳的引物和探针及其试剂盒与方法。

背景技术

银鲳（Pampus argenteu），属于硬骨鱼纲，辐鳍亚纲，鲈形目，是我国主要的海产经济鱼类之一，广泛分布于我国沿海地区，北起渤海南至南海均有银鲳分布。由于银鲳具有较高的经济食用价值，不少商家为了谋求高额利润，在海产品捕捞、加工处理、市场流通等环节，存在以次充好（如用便宜的金鲳代替银鲳）、乱贴标签的现象。目前关于鉴定银鲳的报道较少，主要依赖于传统的形态学鉴别法，但需要从业人员具备较强的专业背景知识，受主观判断影响大，易出错。而以分子生物学为基础的检测方法主要包括微卫星分子标记、随机引物扩增多态性、限制性长度多态性等，但这些方法存在耗时长、操作复杂、重复性差和误差大等弊端。为了对鱼肉及其制品进行溯源，亟需快速、精准、高效的鉴定方法。

发明内容

有鉴于此，本发明所解决的技术问题在于提供一种基于荧光定量PCR检测银鲳的引物和探针。

本发明所解决的技术问题还在于提供一种基于荧光定量PCR检测银鲳的试剂盒。

本发明所解决的技术问题还在于提供一种基于荧光定量PCR检测银鲳的方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种基于荧光定量PCR检测银鲳的引物和探针，包括上游引物FP、下游引物BP、探针Probe，其核苷酸序列分别如下所示：

FP：5’-GCCTATTTACCCAGTTTTC-3’；

BP：5’-GGTCAGGATCTCATTGTA-3’；

Probe：5’-FAM-TCATTCCGAGCAGCCTAGTAGC-TAMRA-3’，其中5’端标记的荧光基团是FAM，3’端标记的淬灭基团是TAMRA。

优选地，扩增反应时，FP引物、BP引物和探针的摩尔比为：2：2：1。

另一方面，本发明还公开了一种基于荧光定量PCR检测银鲳的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1或2中所述的检测引物和探针。

优选地，该基于荧光定量PCR检测银鲳的试剂盒还包括以下成分的部分或者全部：（1）PCR MIX反应液；（2）去离子水；（3）阳性对照和阴性对照。

优选地，所述的PCR MIX反应液含有：5U Taq酶，2.5mM dNTPs，25mM MgCl2，2×PCRbuffer。

再有，本发明还公开了一种基于荧光定量PCR检测银鲳的方法，包括如下步骤：

（1）待检样品DNA的提取；

（2）荧光定量PCR反应体系的配制：将步骤（1）中提取的待检样品DNA加入荧光定量PCR反应体系，混匀后离心，所述荧光定量PCR反应体系中含有如权利要求1或2中所述的引物和探针；

（3）荧光定量PCR反应：设置阳性对照和阴性对照，将配好的荧光定量PCR反应体系置于荧光定量PCR仪后开始反应，反应程序如下：95℃反应10min；95℃反应15sec，60℃反应60sec，45个循环，每循环延伸结束时收集荧光信号；