[发明专利]一株多抑制物胁迫耐受性酿酒酵母及制备方法、应用

说明书

本发明涉及微生物生物技术领域，具体为一株多抑制物胁迫耐受性酿酒酵母及制备方法、应用。主要技术方案如下：该菌株的名称为S288C‑YOL032W，菌株的保藏编号为CGMCC No.13926，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年03月24日；该菌株携带有YOL032W基因，该基因GenBank登录号为NM_001183286.1。该酿酒酵母菌株为单细胞真菌，一般呈卵圆形、圆形。菌落形态与细菌相似，但较大较厚，呈乳白色，表面湿润、粘稠。营养方式为异养兼性厌氧型。在培养基中生长时为游离态，乳白色。本发明的重组酿酒酵母S288C‑YOL032W能在分别含有高浓度乙酸、糠醛和香草醛环境胁迫条件下具有良好的生长和较高的乙醇发酵性能。

技术领域

本发明属于微生物生物技术领域，特别涉及一株多抑制物胁迫耐受性酿酒酵母及制备方法、应用。

背景技术

燃料乙醇作为一种清洁的可再生能源是重要的石油替代品，具有良好的发展前景。以来源丰富且廉价的纤维素生物质农林废弃物为原料生产燃料乙醇，是国内外生物能源发展的重要方向。但是，木质纤维素原料在预处理过程中可产生对细胞生长和代谢具有毒性的副产物，包括弱酸类、醛类和酚类等(Omics：a Journal of Integrative Biology，2011，15：647-653)。这些副产物通过抑制酵母菌有氧呼吸、增加细胞膜透性、破坏胞内酶活性等途径抑制微生物菌体生长和乙醇发酵(Journal of Industrial MicrobiologyBiotechnology，2004，31：345-352)，导致较低的纤维素乙醇生成效率。

YOL032W是磷脂合成蛋白基因，在胆碱存在时该基因的表达明显被抑制，表明YOL032W与磷脂酰胆合成相关(Genetics，2006，173：621-634)。有研究者将单倍体酿酒酵母BY4741的YOL032W基因敲除后其在含山梨酸平板上的生长状态明显下降，表明该基因与弱酸耐性相关(Molecular Biology of the Cell，2004，15：706-720)。而该基因过表达与乙酸、糠醛和香草醛耐受性关系尚有待研究。

发明内容

为弥补现有技术的不足，本发明提供一株多抑制物胁迫耐受性酿酒酵母及制备方法、应用，能在分别含有高浓度乙酸、糠醛和香草醛等环境胁迫条件下良好生长和具有较高的乙醇发酵性能。

本发明的技术方案如下：一株多抑制物胁迫耐受性酿酒酵母S288C-YOL032W(Saccharomyces Cerevisiae)及制备方法、应用，该菌株的保藏编号为CGMCC No.13926，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年03月24日；该菌株携带有YOL032W基因，该基因GenBank登录号为NM_001183286.1。该酿酒酵母菌株为单细胞真菌，一般呈卵圆形、圆形。菌落形态与细菌相似，但较大较厚，呈乳白色，表面湿润、粘稠。营养方式为异养兼性厌氧型。在培养基中生长时为游离态，乳白色。

PGK1启动子序列GenBank登录号为FJ415226.1，CYC1终止子序列GenBank登录号为EF210198.1。通过基因工程手段在酵母的pHO整合载体(NCBI：#AF324728，美国utah大学David J.Stillman惠赠；Nucleic acids research，2001，29：e59)的基础上连接PGK1强启动子和CYC1终止子构成pHO组成型表达载体。然后把PCR扩增获得的YOL032W基因连接在PGK1启动子和CYC1终止子之间，线性化后电转导入酿酒酵母S288C中，进行过表达。导入的目的片段在酿酒酵母基因组的HO基因位点(Yeast，1997，13：1563-1573)进行整合表达。

本发明采用酿酒酵母的pHO组成型表达载体进行重组菌株的整合表达，pHO组成型表达载体可以通过同源重组的方式在酿酒酵母的HO基因位点进行整合表达，该载体通过基因工程手段在质粒的多克隆位点插入PGK1启动子和CYC1终止子，获得组成型整合表达，根据遗传霉素G418抗性进行筛选。