[发明专利]一种铁皮石斛原球茎大量分化及生根方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种铁皮石斛原球茎大量分化及生根方法。

背景技术

铁皮石斛是兰科石斛属多年生草本植物，是传统的名贵中药材。铁皮石斛含有多种有效成分，大体可分为多糖(polysaccharide)、芪类(Stillnoids)、生物碱类(Alkaloids)、氨基酸类及微量元素。其中多糖、生物碱类以及氨基酸类具有提高人体免疫功能、抗氧化、抑制肿瘤和降低血糖等作用。铁皮石斛多糖，其单糖组分由D-木糖，L-阿拉伯糖和D-葡萄糖组成，在植物体内多糖含量高达22.7％。而芪类化合物种类相对较多，目前已从铁皮石斛中分离鉴定的有：双苄酚类及菲酚类化合物毛兰素和鼓槌菲；菲醌母核金钗石斛菲醌；联苄类化合物和石斛酚(gigantol)。而生物碱类因其含量较低，所以目前对其研究也很少。铁皮石斛还富含多种微量元素，其中主要的微量元素有Cu、Zn、Fe、Mn、Cr、Sr、B等，且每种微量元素的含量都很高，为此，铁皮石斛作为保健品、滋补品具有巨大的的研究和开发价值。传统的获得铁皮石斛的方式均是直接采集野生植株。但由于铁皮石斛在自然条件下繁殖率极低，虽然其成熟的每个荚果中含上万，上十万粒的种子，但因为种子太过于细小，其中没有足够的营养成分供其萌发生长，所以相对而言，铁皮石斛自然条件下繁殖系数很低。再加上铁皮石斛生长周期较长，一般需要两到三年的生长周期才可以取来用药。数据显示铁皮石斛的市场需求量连年持续增长，对于野生资源的过度采撷和破坏导致野生铁皮石斛濒临灭绝。

综上所述，铁皮石斛具有很大的药用价值。但由于铁皮石斛自然条件下繁殖系数很低，再加上铁皮石斛生长周期较长以及对于野生资源的过度采撷和破坏导致野生铁皮石斛濒临灭绝。这些弊端使铁皮石斛产业化到很大限制，不能满足日渐增长的市场需求。

发明内容

本发明的目的是建立一种铁皮石斛原球茎大量分化及生根方法，为铁皮石斛定向大规模工厂化生产提供可靠的技术支撑。该方法具有简单实用，高效迅速，适宜规模化生产的特点。

本发明的技术方案具体为：一种铁皮石斛原球茎大量分化及生根方法，包括如下步骤：

(1)无菌外植体的获得：用清洁粉浸泡铁皮石斛蒴果3min，然后捞出用自来水冲洗干净，在无菌条件下用70vt％酒精表面消毒1.5min，无菌水清洗1分钟，再用2wt％的次氯酸钠溶液浸泡10-15min，最后用无菌水清洗4-5次，每次清洗1min，冲洗结束后用灭菌滤纸吸去铁皮石斛蒴果表面的水分，然后接种在增殖培养基中培养30天，得到原球茎；培养条件为培养温度22-26℃；光照时间10-12h/d，光照强度2000lx；

(2)原球茎大量分化：选取状态良好的原球茎接入分化培养基进行原球茎分化培养得到幼苗；

(3)幼苗生根培养：将幼苗接入壮苗生根培养基中进行芽生根培养。

进一步的，所述的增殖培养基配方如下：1/2MS培养基、1-萘乙酸0.2mg/L、6-苄氨基腺嘌呤0.5mg/L、水解乳蛋白0.5g/L-1.0g/L、蔗糖30g/L-40g/L、琼脂5.5g/L-6.5g/L、土豆汁30g/L-70g/L、腺苷酸环化酶1.0g/L-2.0g/L，pH为5.8-6.5。

进一步的，所述的增殖培养基配方如下：1/2MS培养基、1-萘乙酸0.2mg/L、6-苄氨基腺嘌呤0.5mg/L、水解乳蛋白0.5g/L、蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L、土豆汁50g/L、腺苷酸环化酶1.5g/L，pH为5.8。

进一步的，所述的分化培养基的配方如下：1/2MS培养基、1-萘乙酸0.5mg/L、6-苄氨基腺嘌呤0.9mg/L、水解乳蛋白0.8g/L、蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L、土豆汁60g/L、腺苷酸环化酶2.0g/L，pH为5.8。

进一步的，所述的壮苗生根培养基的配方如下：1/2MS培养基、1-萘乙酸1.0mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6g/L、香蕉泥35g/L、腺苷酸环化酶1g/L，pH为5.8。

所述的水解乳蛋白为本领域的常规试剂，市售可得；所述土豆汁由土豆削皮榨汁得到，香蕉泥为去皮香蕉捣碎得到。

本发明与现有技术相比，本发明具有以下的优点和效果：

(1)缩短了铁皮石斛的育苗周期。传统的铁皮石斛育苗周期长，难以满足大规模生产的需求，本发明可以大大缩短铁皮石斛育苗周期；同时通过铁皮石斛原球茎的大量分化及生根进行快速繁殖，保证了铁皮石斛遗传稳定性。