[发明专利]一种交联肽段富集方法及其在蛋白质相互作用研究中的应用

说明书

本发明涉及一种交联肽段富集方法及其在蛋白质相互作用研究中的应用。使用两侧具有反应活性基团且连接臂上含有邻二羟基基团的交联剂将细胞内蛋白质复合体进行交联并酶解，随后采用硼亲和材料对交联肽段进行选择性富集和高效释放。该方法具有操作简便、高效、高通量、高可信度的优点并应用于蛋白质相互作用的分析。

技术领域

本发明涉及一种交联肽段富集方法及其在蛋白质相互作用研究中的应用。

背景技术

交联质谱技术是近十多年来发展起来的新技术，它利用化学交联剂将细胞内空间距离足够接近、可以与交联剂反应的两个氨基酸以共价键连接起来，然后利用基于质谱技术的蛋白质组学对交联产物进行分析，从而实现对蛋白质的空间结构及蛋白质间相互作用方式的解析(Sinz,A.,Expert Rev.Proteomics.,2014,11(6):733-743.)。

然而，使用传统交联质谱技术对质谱鉴定要求很高。由于每个位点的实际交联效率往往远低于100％，所以交联肽段丰度偏低，交联谱图数目少、信号差，给交联谱图鉴定带来困难。此外，对于复杂蛋白质复合体样品，进入质谱分析之前，需要对其进行酶切。交联蛋白质在不同位置发生酶切会生成三种产物：a.被交联剂修饰的单肽，即交联剂一端发生水解，仅一端与肽段进行反应(Type-0型肽段)；b.肽段内部交联，即交联剂两端结合位点在同一条肽段上(Type-1型交联肽段)；c.肽段间交联，即交联剂两端结合位点分别在两条肽段上(Type-2型交联肽段)。由于交联试剂两侧的反应基团水解速率快，Type-0型肽段含量远高于蛋白质相互作用解析所需的Type-1型和Type-2型交联肽段。

为提高交联肽段的丰度，目前已发展出含有不同类型富集基团(如炔基-叠氮、生物素-亲和素等)的交联试剂，然而，由于三种产物中均含有交联剂，因此使用含常规富集基团的交联试剂无法将交联肽段与Type-0型肽段进行分离。此外，由于加入特定基团的缘故，一般臂长要比简单的交联剂更长，这使得交联效率有所下降，得到的交联位点之间的距离限制作用也会变弱。同时，大分子量基团的引入会导致交联肽段在质谱中更加难以碎裂。

发明内容

为了克服常规化学交联方法无法实现对交联肽段选择性富集，且会在交联肽段上引入修饰基团等不足，本发明提供一种使用连接臂上含有邻二羟基基团的交联剂将细胞内蛋白质复合体进行交联并酶解，随后采用硼亲和材料选择性富集交联肽段并高效释放。该方法具有操作简便、高效、高通量、高可信度的优点并应用于蛋白质的结构分析及蛋白质复合体相互作用结合位点的分析。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

(1)蛋白质/细胞样品溶液及交联剂溶液的配制：对于胰酶消化或细胞刮消化得到的活细胞样品，使用pH为7.1-10的碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲盐溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液中的一种或二种以上，且不含与所用交联剂上反应基团反应的基团的缓冲液冲洗去除培养液并使细胞悬浮；对于单一蛋白样品或混合蛋白样品，使用水或缓冲液配制成浓度为1μg/mL-100mg/mL的蛋白溶液；使用水、缓冲液或乙腈、有机醇类、有机酸类、DMF或DMSO中的一种或二种以上的有机溶剂配制成浓度为1μM-1M的交联剂溶液，使用的交联剂两侧含有琥珀酰亚胺、卤代芳烃、亚胺酸酯、马来酰亚胺、2-巯基吡啶、硫代磺酸盐、卤代乙酰基、碳二亚胺、异氰酸盐、酰肼、苯基叠氮、双吖丙啶等上述一种或两种反应基团，且连接臂上含有邻二羟基基团；

(2)交联反应：将交联剂溶液加入至细胞样品或蛋白样品中进行反应，对于细胞样品，反应体系中细胞浓度为10⁶-10⁹个/mL，对于蛋白样品，反应体系中蛋白浓度为1nM-1mM，交联剂的浓度为10nM-100mM；所述的反应条件为15-40℃反应10min-2h或0-10℃反应10min-10h；