[发明专利]一种交联肽段富集方法及其在蛋白质相互作用研究中的应用

权利要求书

1.一种用于交联肽段富集的方法，其特征在于：使用连接臂上含有邻二羟基基团的交联剂对细胞或提取的蛋白质样品进行交联，将交联蛋白质样品进行酶解后，采用硼亲和材料选择性富集交联肽段，从而获取蛋白质结构及蛋白质相互作用信息；

具体包括：

（1）对于细胞样品，使用缓冲液冲洗去除培养液并使细胞悬浮；对于已提取出的蛋白样品，使用水或缓冲液配制成溶液；对于交联剂，使用水、缓冲液或有机溶剂配制成溶液；

（2）将交联剂溶液加入至细胞样品溶液或蛋白样品溶液中进行反应；

（3）对于细胞样品，离心弃去反应体系中的反应液，然后对细胞样品进行裂解，得交联蛋白样品；对于蛋白样品，向反应体系中加入反应终止液，或通过透析、滤膜或凝胶去除反应液，得交联蛋白样品；

（4）采用pH为1-6.5的酸性缓冲溶液或pH为7.5-14的碱性缓冲溶液配制的溶有表面活性剂或有机溶剂的溶解液来溶解交联蛋白样品，加入还原剂，高温孵育，同时进行蛋白质样品的变性及还原；

（5）加入烷基化试剂对变性及还原后的蛋白质样品进行烷基化反应后，向蛋白质样品中加入蛋白酶溶液进行酶解，并将酶解产物进行除盐并冻干；

（6）向步骤（5）的产物中加入带有硼亲和基团的富集材料；

（7）使用洗脱液洗去富集材料上非特异性吸附的肽段；

（8）使用酸性溶液将富集材料上键合的肽段释放出来，除盐，冻干并重溶，进行质谱分析和数据检索；

步骤（1）中所述的交联剂浓度为1 µM-1 M；

所述的交联剂为两侧具有与蛋白上氨基反应的活性基团的化学物，活性基团为琥珀酰亚胺基团、卤代芳烃基团、亚胺酸酯基团中的一种或二种；或为两侧具有与蛋白上巯基反应的活性基团的化学物，活性基团为马来酰亚胺基团、2-巯基吡啶基团、硫代磺酸基团、卤代乙酰基团中的一种或二种；或为两侧具有与蛋白上羧基反应的活性基团的化学物，活性基团为碳二亚胺基团、异氰酸基团中的一种或二种；或为两侧具有与蛋白上糖链反应的活性基团的化学物，活性基团为酰肼基团、氨基基团中的一种或二种；或为两侧具有与蛋白上任意基团反应的活性基团的化学物，活性基团为苯基叠氮基团、双吖丙啶基团中的一种或二种；所述的交联剂，其两侧活性反应基团分别为上述任一反应基团；所述的交联剂，其连接臂上的化学富集基团，为邻二羟基基团；

步骤（3）中所述的反应终止液为具有能与交联剂两侧反应基团反应的基团的物质；

步骤（6）中所述的硼亲和基团的单体为2-羧基苯硼酸、5-羧基-2-羟甲基苯硼酸、4-甲酰基苯硼酸、氨基苯硼酸或5-氨基-2-羟甲基苯硼酸中的一种或二种以上；

所述富集材料的基质为琼脂糖凝胶球、硅球或聚合物球有机/无机材料；

步骤（7）中所述的洗脱液为下述中的一种：浓度为0.1-8 M的氯化钠溶液、0.1-8 M的氯化钾溶液、0.1-1 M的碳酸钠溶液、2-10 M的尿素溶液、1-8 M的盐酸胍溶液或10-1000 mM的碳酸氢铵溶液；乙腈、甲醇、异丙醇；十二烷基磺酸钠、Triton X-100、Chaps、Tween；

步骤（8）中所述的交联肽段释放溶液为pH为1-6.5的酸性溶液，酸性溶液为甲酸、三氟乙酸、三氯乙酸或醋酸溶液中的一种或二种以上。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的缓冲液为pH为7.1-10的碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲盐溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液中的一种或二种以上，且不含能与所用交联剂上反应基团反应的基团；

步骤（1）中所述的细胞样品，为胰酶消化或细胞刮消化得到的活细胞样品；步骤（1）中所述的蛋白样品，为单一蛋白样品或二种以上蛋白的混合蛋白样品，配制的蛋白质量与溶液的体积比为1 µg/mL-100 mg/mL；步骤（1）中所述的有机溶剂，为乙腈、有机醇类、有机酸类、二甲基甲酰胺(DMF）或二甲基亚砜 (DMSO) 中的一种或二种以上。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的反应体系中细胞浓度为10⁶-10⁹个/mL，蛋白终浓度为1 nM-1 mM，交联剂的终浓度为10 nM-100 mM；所述的反应条件为15-40℃反应10 min-2 h或0-10℃反应10 min-10 h。