[发明专利]同步检测玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1的试纸卡、制备及检测方法

权利要求书

1.同步检测玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1的试纸卡，包括卡壳和设在卡壳内的试纸条；卡壳包括相互扣合的卡盖和卡座；试纸条包括底板以及依次搭接粘贴在底板上的吸水垫、检测垫、结合垫和样品垫；卡盖上对应于检测垫的区域设有视窗，卡盖上对应于样品垫的区域设有加样孔，卡座内设有固定试纸条的卡槽；所述底板为不吸水的PVC板，吸水垫为吸水滤纸；其特征在于：所述检测垫为设有质控线C、检测线T1和检测线T2的硝酸纤维素膜，质控线C包被羊抗鼠单克隆抗体，检测线T1包被玉米赤霉烯酮半抗原-牛血清白蛋白偶联物，检测线T2包被黄曲霉毒素B1半抗原-牛血清白蛋白偶联物；所述结合垫为包埋时间分辨荧光微球标记的玉米赤霉烯酮单克隆抗体及黄曲霉毒素B1单克隆抗体的玻璃纤维素膜；所述样品垫是经样品垫处理液浸泡处理后干燥的玻璃纤维素膜。

2.如权利要求1所述同步检测玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1的试纸卡，其特征在于：所述质控线C、检测线T1或检测线T2是将包被液划膜于检测垫制得，其中，羊抗鼠单克隆抗体包被液的浓度为0.5mg/mL，玉米赤霉烯酮半抗原-牛血清白蛋白偶联物包被液的浓度为0.3 mg/mL，黄曲霉毒素B1半抗原-牛血清白蛋白偶联物包被液的浓度0.3 mg/mL。

3.如权利要求1所述同步检测玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1的试纸卡，其特征在于：所述时间分辨荧光微球为直径200nm的含有高亮稀土染料的羧基聚苯乙烯微球。

4.如权利要求1所述同步检测玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1的的试纸卡，其特征在于：所述结合垫是将荧光微球-抗体复合物溶液喷至玻璃纤维素膜上制得，所述荧光微球-抗体复合物溶液中，玉米赤霉烯酮单克隆抗体的浓度为8μg/mL，黄曲霉毒素B1单克隆抗体的浓度为6μg/mL。

5.如权利要求1所述同步检测玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1的的试纸卡，其特征在于：所述样品垫处理液为pH 8.0 的PBS缓冲液，其中含有的成分及其浓度分别为：质量分数为0.5%的蔗糖，质量分数为0.5%的PVP-K30，质量分数为0.5% 的PEG-20000，质量分数为0.1% 的PEG-6000，质量分数为0.3%的酪蛋白，体积分数为0.5%的Tween 20，质量分数为0.1%的S9，质量分数为0.1%的S17和质量分数为0.1%的S21。

6.制备如权利要求1-5任意一种同步检测玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1的试纸卡的方法，其特征在于：

所述检测垫的制备：根据质控线C、检测线T1和检测线T2上的包被物，分别制备含有相应包被物的三种包被液，包被液浓度均为0.3-0.5 mg/mL，将包被液各自单独倒吸至划膜机管线中，在硝酸纤维素膜上均按照0.8μL/cm划出，完成质控线C、检测线T1和检测线T2上的包被，然后置于37℃鼓风干燥箱中干燥3-4 h，制得检测垫；

所述结合垫的制备：将荧光微球分散液置于离心管中；加入MES缓冲液，在超声条件下混匀，离心弃上清收集微球沉淀，重复此步骤以清洗微球；将微球沉淀溶解于MES缓冲液中，混匀，加入EDC溶液，22-25℃避光活化，离心弃上清，加MES缓冲液，超声打散微球，离心弃上清；加入硼酸缓冲液，超声打散，然后加入玉米赤霉烯酮单克隆抗体混匀，再加入黄曲霉毒素B1单克隆抗体，避光反应；加入甘氨酸溶液，避光反应30min，再加入BSA溶液，避光反应30min，完成封闭；离心复溶，形成荧光微球-抗体复合物溶液；将荧光微球-抗体复合物溶液喷至玻璃纤维素膜上，干燥，制得结合垫；

所述样品垫的制备：将玻璃纤维素膜放入配置好的样品垫处理液中，浸泡0.5 h，放入37℃鼓风干燥箱中，干燥8-10 h，制得样品垫；

试纸卡的组装：以PVC板为底板，将样品垫、结合垫、检测垫和吸水垫依次搭接粘贴在底板上，每个相邻处搭接时有1-2mm重叠，并使检测垫上的检测线T1和检测线T2靠近样品垫一侧、质控线C靠近吸水垫一侧，用切条机将贴好的PVC板切成条状，与卡壳组合并密封保存。

7.利用权利要求1-5任意一种所述试纸卡定量检测饲料中玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1的检测方法，其特征在于：称取经均质器均质的饲料样品置于离心管中，加入70%的甲醇水溶液，振荡器剧烈震荡至少5min，离心取上清，用样品稀释液稀释，得样品检测液；将样品检测液加入加样孔中，反应10min，将试纸卡插入荧光免疫分析仪的卡槽中，读取T/C值，根据浓度标准曲线，计算得到对应样品中所检毒素的浓度。