[发明专利]用于伊马替尼相关基因C‑kit表达水平检测的引物组、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及体外诊断技术领域，尤其涉及一种用于伊马替尼相关基因C-kit表达水平检测的引物组、试剂盒及方法。

背景技术

C-kit(V-kit hardy-zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog)蛋白属于原癌基因C-kit编码的Ⅲ型跨膜受体酪氨酸激酶家族成员，由胞内的酪氨酸激酶区，跨膜区和带有配体结合位点胞外区构成。与其配体结合后能激活自身酪氨酸蛋白酶活性，通过一系列反应激活下游信号转导通路，如：PI3K通路、JAK-STAT通路、Ras-Erk通路、SFK通路、磷酯酶C通路等，最终活化细胞内的转录因子，从而调节基因表达、控制细胞生长和增殖。研究发现，C-kit的过表达引起肺癌的扩散，因此在治疗中阻断C-kit的表达会提高治疗的抗癌功效。另外，C-kit的高表达是胃肠道间质瘤(GIST)发生的核心事件。

伊马替尼是一种酪氨酸蛋白酶抑制剂，作用于酪氨酸蛋白激酶受体的ATP结合位点，从而阻止磷酸化的进行和信号通路的传导，最终抑制肿瘤细胞增殖而诱导细胞凋亡。研究发现，在GIST的治疗中，C-kit mRNA高表达时，对伊马替尼具有较强敏感性。另外在一项对黑色素瘤的研究中发现，C-kit的基因扩增在患者中的比率为7.4％，对这些患者使用伊马替尼，提高了患者的无进展生存期和中位无进展生存期。

目前，在临床疾病标志物实际的检测方法中，主要应用免疫组化法(化学染色)、流式细胞技术、免疫放射法等，技术普及性好、观察直观且相对传统，但存在实验过程过于繁琐，需要试剂种类繁多，结果读取主观影响较大等缺点，一定程度上限制了该方法临床上的进一步应用。近年来，Real Time-PCR凭借检测时间短、检测敏感性高(是免疫组织化学染色法的10倍以上)，而且能对PCR进行实时在线检测，反应基因在组织中的初始含量，试验节约了大量的检测时间，还避免了遗留污染的发生等优点逐渐在临床上部分取代传统检验方法。常见方法有SYBR GreenI染料法、双探针杂交法及Taqman探针技术；其中SYBR GreenI法由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法及Taqman法，且必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。

综上所述，本发明采用TAQMAN探针技术与实时荧光PCR技术相结合的检测试剂盒，适用于临床推广和产业化。

发明内容

为了解决免疫组化法检测临床生物标志物时存在实验过程过于繁琐，需要试剂种类繁多，结果读取主观影响较大的技术问题，本发明提供一种操作简单、检测时间短、检测敏感性高及特异性好的用于伊马替尼相关基因C-kit表达水平检测的引物组、试剂盒及方法。

本发明提供一种用于伊马替尼相关基因C-kit表达水平检测的引物组，所述引物组包括分别针对C-kit基因和参考基因Actin的特异性引物及探针，其中：

C-kit-RF上游引物：

5’-CAGATTTCAGAGAGCACCAATCA-3’；

C-kit-RR下游引物：

5’-AATGGTCTACCACGGGCTTCT-3’；

C-kit-RP探针：

5’-FAM-TTACTCCAACTTAGCAAACTGCAGCCCCAA-TRAMA-3’；

Actin-RF上游引物：

5’-CCGACAGGATGCAGAAGGAG-3’；

Actin-RR下游引物：

5’-AGGATGGAGCCGCCGAT-3’；

Actin-RP探针：

5’-FAM-ATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGC-TRAMA-3’。

本发明还提供一种用于伊马替尼相关基因C-kit表达水平检测的试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括针对C-kit基因和参考基因Actin的特异性引物及探针，其中：

C-kit-RF上游引物：

5’-CAGATTTCAGAGAGCACCAATCA-3’；

C-kit-RR下游引物：

5’-AATGGTCTACCACGGGCTTCT-3’；

C-kit-RP探针：

5’-FAM-TTACTCCAACTTAGCAAACTGCAGCCCCAA-TRAMA-3’；

Actin-RF上游引物：

5’-CCGACAGGATGCAGAAGGAG-3’；