[发明专利]一种利用猪原代肝细胞和hNTCP重组慢病毒建立乙肝病毒感染细胞模型的方法

说明书

本发明公开了一种利用猪原代肝细胞和hNTCP重组慢病毒建立乙肝病毒感染细胞模型的方法，属于细胞改造技术领域。其包括如下步骤：步骤1：制备hNTCP重组慢病毒浓缩液；步骤2：制备消化完全的肝组织；步骤3：制备猪原代肝细胞；步骤4：制备猪原代肝细胞单细胞悬液；步骤5：制备铺板用细胞悬液；步骤6：细胞铺板与培养；步骤7：对猪原代肝细胞进行hNTCP重组慢病毒感染；步骤8：建立乙肝病毒感染细胞模型。本发明在体外构建含hNTCP基因的重组慢病毒，通过高感染效率的慢病毒将hNTCP基因整合到猪原代肝细胞基因组中，实现hNTCP稳定过表达，使猪原代肝细胞支持乙肝感染。

技术领域

本发明涉及一种利用猪原代肝细胞和hNTCP重组慢病毒建立乙肝病毒感染细胞模型的方法，属于细胞改造技术领域。

背景技术

乙肝病毒(英文缩写为HBV)感染是中国的“国病”，中国约有9000万乙肝携带者，每年死于乙肝感染相关疾病的人数约一百万。由于缺乏合适的HBV感染细胞模型，抗HBV药物的研发相对滞后。尽管乙肝疫苗可以保护健康人免受乙肝侵扰，但对于基数庞大的乙肝携带者，目前尚无治愈性药物。HBV感染细胞模型及动物模型对于抗HBV药物研发至关重要。

长期以来，抗HBV药物筛选与评价的细胞模型局限于肝癌细胞系如HepG2、HepG2.2.15、Huh7等等。由于这些细胞系去分化严重，与体内肝细胞相比在分化状态上相差甚远，所以在筛选与评价抗HBV药物时不能反映药物真实的抗病毒效果与细胞毒作用。Na⁺/牛磺胆盐共转运多肽(human Na⁺/taurocholate cotransporting polypeptide，hNTCP)被证明是乙肝受体后，基于肝癌细胞系HepG2、Huh7构建了HBV感染细胞模型，在HBV基础研究及抗HBV药物研发中发挥着重要作用。但这类细胞系的分化状态相对较低，且感染效果不理想。

人原代肝细胞由于保持了肝内环境的原始状态，在抗HBV药物研发中被公认为“金标准”。人原代肝细胞是HBV研究及抗病毒药物研发的最佳模型，但人原代肝细胞存在来源有限、批次差异大、医学伦理问题等缺点，这种细胞并不能在HBV基础研究及抗HBV药物研发中被广泛使用。实验证实，来自于小鼠和大鼠的肝癌细胞系在过表达hNTCP后仍然不支持HBV感染，说明HBV对人肝细胞的高度嗜性与种属特异性，其它动物的肝细胞很有可能不支持HBV感染，这形成了一种偏见。

基于猪与人遗传距离相近、肝脏转录组相似性及猪血清流行病学调查，在猪原代肝细胞中过表达hNTCP后极有可能支持HBV感染，从而制备出HBV易感的原代细胞模型及动物感染模型。再者，由于普通转染试剂如Lipo2000和电转染，极难实现对原代肝细胞的高效基因操作。而慢病毒可实现对原代肝细胞的高效感染与基因整合表达。但目前，尚未有利用猪原代肝细胞和hNTCP重组慢病毒建立乙肝病毒感染细胞模型的方法。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种利用猪原代肝细胞和hNTCP重组慢病毒建立乙肝病毒感染细胞模型的方法。本发明在体外构建含hNTCP基因的重组慢病毒，通过高感染效率的慢病毒将hNTCP基因整合到猪原代肝细胞基因组中，实现hNTCP稳定过表达，使猪原代肝细胞支持乙肝感染。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种利用猪原代肝细胞和hNTCP重组慢病毒建立乙肝病毒感染细胞模型的方法，包括如下步骤：

步骤1：制备hNTCP重组慢病毒浓缩液

利用磷酸钙转染法，将慢病毒包装质粒pCMV dr8.91、慢病毒包装质粒pMD.2G和hNTCP过表达质粒pWPI-hNTCP-Puro按质量比2:1:3，同时转染到293T细胞中，转染后48h收集含慢病毒的培养上清，浓缩后，得到hNTCP重组慢病毒浓缩液；

步骤2：制备消化完全的肝组织

通过两步胶原酶灌注法，消化分离猪原代肝细胞，得到消化完全的肝组织；