[发明专利]一种利用猪原代肝细胞和hNTCP重组慢病毒建立乙肝病毒感染细胞模型的方法

权利要求书

1.一种利用猪原代肝细胞和hNTCP重组慢病毒建立乙肝病毒感染细胞模型的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：制备hNTCP重组慢病毒浓缩液

利用磷酸钙转染法，将慢病毒包装质粒pCMV dr8.91、慢病毒包装质粒pMD.2G和hNTCP过表达质粒pWPI-hNTCP-Puro按质量比2:1:3，同时转染到293T细胞中，转染后48h收集含慢病毒的培养上清，浓缩后，得到hNTCP重组慢病毒浓缩液；

其中，所述磷酸钙转染法具体为：无菌条件下，向第一个离心管中分别加入450μL去离子水、50μL 2mol/L氯化钙溶液、10μg慢病毒包装质粒pCMV dr8.91、5μg慢病毒包装质粒pMD.2G和15μg hNTCP过表达质粒pWPI-hNTCP-Puro，混匀形成转染溶液I；在另一个离心管中加入500μL 2×HBS溶液，边震荡，边滴入转染溶液I，形成转染溶液II，常温静置20min；将转染溶液II加入到直径为10cm、细胞融合度70-80％、含有10mL DMEM转染培养液的293T细胞培养皿中，在37℃、5％CO₂培养箱中培养12h后，将DMEM转染培养液换成新鲜DMEM培养液，即转染结束；

所述浓缩的方法为：先将慢病毒上清置于4℃水平离心机中，3800×g/min，离心10min，用0.45μm滤膜过滤后，取15mL过滤液加入到100KD超滤管中，然后再将上述100KD超滤管转移至4℃水平离心机中，4000×g/min，离心30min后，即得到hNTCP重组慢病毒浓缩液；

步骤2：制备消化完全的肝组织

通过两步胶原酶灌注法，消化分离猪原代肝细胞，得到消化完全的肝组织；其中，所述两步胶原酶灌注法，是将新鲜的猪肝组织先通过4℃预冷的灌注溶液I灌注20min，直至肝组织中的血液被冲洗干净，再用37℃预热的灌注溶液II灌注30min，直至肝组织失去弹性；

步骤3：制备猪原代肝细胞

将步骤2得到的消化完全的肝组织，转移至含有细胞洗液的培养皿中，得到猪原代肝细胞细胞悬液；

步骤4：制备猪原代肝细胞单细胞悬液

将步骤3得到的猪原代肝细胞细胞悬液，过细胞筛，得到猪原代肝细胞单细胞悬液；

步骤5：制备铺板用细胞悬液

将步骤4得到的单细胞悬液离心，用细胞洗液重悬后，再重复离心3次，用铺板培养液重悬细胞，得到铺板用细胞悬液；

步骤6：细胞铺板与培养

将步骤5得到的铺板用细胞悬液以(1.5-2.5)×10⁵活细胞/cm²的接种密度，接种到胶原包被的培养板或培养皿中，加入铺板培养液，摇匀，在37℃、5％CO₂培养箱中培养4-6h后，将铺板培养液换成肝细胞维持培养基PMM，得到培养好的猪原代肝细胞；

步骤7：对猪原代肝细胞进行hNTCP重组慢病毒感染

将步骤1得到的hNTCP重组慢病毒浓缩液，以感染复数为1感染步骤6得到的培养好的猪原代肝细胞，感染孵育24h，换成新鲜的肝细胞维持培养基PMM,每2天换1次，感染后第4天检测hNTCP蛋白表达，得到hNTCP蛋白过表达的猪原代肝细胞；

步骤8：建立乙肝病毒感染细胞模型

向步骤7得到的hNTCP蛋白过表达的猪原代肝细胞中，先加入乙肝病毒感染阻断剂，孵育30min后，再以感染复数为1000感染乙肝病毒，感染16-24h后换成新鲜的肝细胞维持培养基PMM，每2天更换1次，感染后第8天检测乙肝病毒感染指标，即得到所述利用猪原代肝细胞和hNTCP重组慢病毒建立乙肝病毒感染细胞模型。

2.根据权利要求1所述的一种利用猪原代肝细胞和hNTCP重组慢病毒建立乙肝病毒感染细胞模型的方法，其特征在于，所述DMEM转染培养液，为DMEM培养基中加入10％v/v胎牛血清；所述新鲜DMEM培养液，为DMEM培养基中加入100units/mL青霉素、100mg/mL链霉素和10％v/v胎牛血清。