[发明专利]一种MGMT基因启动子甲基化的检测方法及其引物组

说明书

本发明涉及分子生物学基因技术领域和医学领域，具体公开了一种MGMT基因启动子甲基化的检测方法及其引物组。本发明对MGMT基因启动子CpG岛甲基化程度进行分析，设计相应的引物组，对样本基因组DNA进行甲基化特异性PCR(MSP)扩增后，以Ion Torrent半导体芯片测序技术进行检测。本发明的检测方法具有通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，检测速度快的优点。为MGMT基因启动子甲基化的检测、测试、分析和评估提供了一条快速、可靠、准确的新途径，从而为筛选敏感个体的个性化用药提供理论基础。

技术领域

本发明涉及分子生物学基因技术领域和医学领域，涉及用分子生物学方法检测MGMT基因启动子CpG岛甲基化的程度，特别涉及用Ion Torrent半导体芯片测序技术对MGMT基因启动子CpG岛甲基化程度进行定性、定量检测的相关引物及其试剂盒。

背景技术

恶性脑胶质瘤是人类难治性肿瘤之一，尽管脑胶质瘤的治疗方法已经由单一的手术治疗发展到今天的手术加放疗和化疗等综合治疗，但是在过去的几十年里，恶性脑瘤患者的预后并没有得到明显的改善, 耐药是化疗疗效不佳的主要原因。

一些研究资料已经证实DNA修复酶O⁶ -甲基鸟嘌呤- DNA甲基转移酶 (O⁶-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT)可以抑制烷化剂对肿瘤细胞的杀伤。而MGMT的表达与MGMT基因的活性密切相关。MGMT基因的活性是受一个启动子控制的，在肿瘤细胞中MGMT基因启动子甲基化可以使MGMT基因沉默，从而不再产生MGMT。在脑胶质瘤细胞中检测MGMT基因启动子是否甲基化，可以判断肿瘤细胞是否对烷化剂产生敏感，从而进一步判断烷化类药物的治疗疗效。

烷化剂是一种很高的反应分子，能够通过与DNA结合而导致细胞死亡。烷基化在DNA上最常见的作用位点是鸟嘌呤的O⁶位置，在这里烷基化使DNA的相邻的两条链构成了交叉连接，这就解释了为什么烷化剂可以杀死肿瘤细胞。由烷化剂作用构成的双链DNA之间的交叉连接可以被O⁶ -甲基鸟嘌呤- DNA甲基转移酶MGMT抑制。MGMT蛋白可以在鸟嘌呤的O⁶位置迅速地反转烷基化，从而避免这种致命交叉连接的构成。通过这样一种机制，MGMT可以引起机体对烷化类药物的耐药。

MGMT的水平在不同类型的肿瘤之间有很大的不同，甚至在相同类型的不同个体之间也存在着差异。例如，大约30%的脑胶质瘤缺乏MGMT，这种酶的缺陷增加了脑肿瘤对烷化类药物的敏感。因为MGMT基因通常不会突变或缺失的，因此MGMT的匮乏基本上是由于细胞中基因信息的改变而引起的。

在人类，DNA甲基化是一种主要类型的表观遗传修饰，并且在肿瘤发生中起着非常重要的作用。尤其，在被称为CpG(cytidine phosphate guanosine)岛，位于肿瘤抑制和DNA修复基因的启动子区域的通常的非甲基化位点，这些位点与原发性肿瘤密切相关。MGMT基因CpG岛的甲基化防止了MGMT基因的转录。

替莫唑胺（Temozolomide，TMZ）作为第二代口服抗肿瘤烷化类药物，通过实验和临床研究证明，其提高了多形性胶质母细胞瘤间变形星形细胞瘤患者的生存率、生活质量，延长了无肿瘤进展生存期，降低了复发率、致残率和死亡率。目前由于部分患者对其有一定的耐药性和不良反应，因此从分子生物学的角度对MGMT基因启动子CpG岛的甲基化状态进行分析，对帮助判断替莫唑胺治疗脑胶质瘤的适应症和耐药性就显得至关重要。一种能够方便快捷的检测MGMT基因启动子CpG岛的甲基化状态，对于改善患者的预后有着十分重要的意义。