[发明专利]一种微生物发酵法生产L‑羟脯氨酸的方法

说明书

技术领域

一种微生物发酵法生产L-羟脯氨酸的方法，属于发酵过程优化技术领域。

背景技术

L-羟脯氨酸为亚氨基酸，是胶原蛋白的主要组成部分，不属于20种常见的氨基酸，它是脯氨酸羟基化后的产物。近些年来，L-羟脯氨酸的研究和开发已经引起医药、生化、食品及美容等产业的广泛关注。它可以作为化妆品添加剂，具有抗氧化、抗辐射的作用；它具有减肥作用，可望成为比较理想的减肥药物；它具有多种生理功能与独特的生物活性，既可以作为各种软组织疾病的药物，如结蹄组织受损、风湿性关节炎等，又可以加快伤口愈合，以及治疗各种皮肤病；它可以作为氨基酸注射液的重要成分，它对急慢性肝病所导致的低蛋白血症有一定的疗效；它参与脂肪的乳化及红细胞血红素和球蛋白的形成，具有调节脂肪乳化等作用；它还是多种药物，如第三代抗生素、抗肿瘤、抗高血压及新型胃药等的合成原料。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用微生物发酵生产L-羟脯氨酸的工艺，该方法能够将发酵原料（主要为葡萄糖）高效的转化为L-羟脯氨酸，相对于目前的发酵技术具有较高的转化率，较低的成本并且环保无污染。

根据实验结果，可以得出在微生物发酵生产L-羟脯氨酸过程中，不同的营养成分配方、不同的溶氧控制、不同温度控制，对最终产量影响较大。为了最大量的提高原料与设备的利用率，缩短发酵所需时间，增大L-羟脯氨酸的产量，本发明提出了一种经过试验稳定的高产工艺方法，使微生物在更利于产物积累的营养配方，溶氧，温度条件下进行发酵。具体操作方法如下。

本发明的技术方案：微生物菌种通过甘油管接种至摇瓶培养活化，然后移至种子罐培养扩大，种子罐培养结束移至发酵罐，控制发酵罐各项参数至发酵结束。具体步骤如下：

步骤一， 摇瓶培养基配方：酵母抽提物5g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L，配置150mL于1000mL锥形瓶中，高压蒸汽灭菌柜内灭菌，121℃、0.1MPa灭菌20min，冷却至室温后，接种甘油管菌种，摇床培养12h，摇床转速200rpm，温度36℃；

步骤二， 种子罐培养基为：酵母抽提物6g/L，蛋白胨12 g/L，氯化钠10 g/L，消泡剂0.1 g/L，配置15L于50L发酵罐内，高温高压蒸汽灭菌保压0.1MPa、保温121℃维持15min，冷却至36℃； 摇瓶培养结束后培养液移至灭菌冷却后的种子罐，接种量为150ml，占种子罐料液体积1%，接种后调节种子罐转速250rpm，通气比3vvm，温度36℃，压力0.05MPa，培养时间4h；

步骤三，发酵罐培养基配方为：酵母抽提物12 g/L，甘油80 g/L，硫酸铵10 g/L，磷酸二氢钾4 g/L，硫酸镁2 g/L，氯化钠2 g/L，氯化钙0.2 g/L，氯化锌0.02 g/L，硫酸锰0.0002 g/L，硫酸亚铁6 g/L，消泡剂0.6 g/L，配置20L于50L发酵罐内，高温高压蒸汽灭菌保压0.1MPa、保温121℃维持15min，冷却至36℃。

步骤四，种子罐培养结束后移种至灭菌冷却后的发酵罐内，发酵罐移种量为5L，占发酵罐初始料液体积的25%，移种后调节发酵罐转速250rpm，通气比2vvm，温度初始值36℃，压力0.05MPa，校正溶氧初始值为100%；

步骤五，发酵罐培养过程中搅拌转速与溶氧水平DO值相关联，搅拌转速与溶氧水平DO值关联通过发酵罐自动化控制系统实现，当溶氧水平由初始DO值100%下降至35%，搅拌转速自动调节维持DO35%，发酵周期20h后设置溶氧DO值为25%，转速自动调节DO25%至发酵结束；

步骤六， 发酵罐培养过程中在周期0h～20h控制温度为36℃，20h后控制发酵温度为33℃，直至发酵结束，当发酵液中L-羟脯氨酸量不再增加时，结束发酵。

根据实验结果，利用本发明能显著提高L-羟脯氨酸的产量。本发明所提供的L-羟脯氨酸发酵工艺简单、高效，有着重要的工业应用价值，同时对其它氨基酸等的发酵法生产具有一定的指导和启迪意义。

具体实施方式

本发明所用的微生物菌种保藏采用甘油管超低温保藏。发酵过程采用二级发酵罐发酵。本发明实验所用的发酵罐为50L发酵罐。

本发明50L罐所使用的培养基所含的营养成分与工业生产所用培养基所含的营养成分相同，所以达到的成果可以很简便地转化到工业规模水平上。