[发明专利]一种黄芩蛋白纳米颗粒及其制备方法

说明书

本发明提供了一种黄芩蛋白纳米颗粒及其制备方法，经过分离纯化获得了一个分子量为36.8 kDa、等电点为6.6的黄芩蛋白，该黄芩蛋白的N‑端一级结构序列为SAVXSKSPEY。该黄芩蛋白的盐溶液在蛋白浓度为1 mg/mL，pH7.5条件下，经过80‑100℃加热60 min后，制备得到黄芩蛋白纳米颗粒，其平均粒径为85.6±2.8 nm。黄芩蛋白纳米颗粒冻干品流动性佳，复溶性好，易于稳定保存。本发明涉及的黄芩蛋白纳米颗粒除安全高效发挥自身功效外，还有望作为载体应用于多种药物的体内递送。

技术领域

本发明涉及医药技术领域中的蛋白药物新剂型和制剂技术，具体涉及到一种黄芩蛋白纳米颗粒及其制备方法。

背景技术

纳米颗粒被大量应用于药物运输体系的开发研究中，其中包括金属聚集体、无机颗粒、超支化聚合物、聚合物胶束等各种不同材料制备的纳米药物载体。各种纳米药物载体有其优点，但也暴露出在生物相容性、细胞毒性和可降解性方面的缺点。经过材料的纳米化后，纳米材料的物化性质（光学、电学、表面活性等）均会呈现与原始材料截然不同的性质。目前应用于纳米药物载体研究的生物大分子（如血清白蛋白、丝蛋白等）皆没有可以参照的天然研究模型，获得纳米颗粒的物化性质及其相关生物安全性也需要长期的观测，才能得到全面评估。纳米药物载体发展带来的潜在风险引起了科学界广泛的担忧。而人民多年服用的汤剂的煎煮过程中自组装形成的纳米颗粒的研究可以解决现阶段纳米药物载体研究缺乏研究原型和对安全性担忧方面的问题。

黄芩在中药汤剂，特别是中药复方汤剂中具有非常重要的用途。黄芩性寒、味苦，清热燥湿、泻火解毒、止血安胎，可清肺火，药理作用广泛；黄芩还具有抗氧化、清除自由基作用、抗肿瘤作用、抗菌抗病毒、抗炎抗过敏作用和对中枢神经系统的保护等生物学效应，其重要的应用价值，不断引起国内外广泛研究者的重视。但是到目前为止，有关黄芩蛋白纳米颗粒的研究国内外尚未见文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黄芩蛋白纳米颗粒及其制备方法。针对化合物在纳米化后，在安全性上的不确定性，本发明涉及的黄芩蛋白纳米颗粒的设计从两个“天然”体系出发：一是天然存在于食品中的蛋白质成分，二是该蛋白质的纳米化过程发生在热加工过程，其纳米颗粒存在于各种熬制的“汤”中被广泛服用。本发明得到的黄芩蛋白纳米颗粒体外细胞实验显示了其极低毒性，表面规则，粒径分布均匀，稳定性好等特点。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种黄芩蛋白，其N-端一级结构序列为SEQ ID NO:1：SAVXSKSPEY。

所述的黄芩蛋白分子量为36.8 kDa、等电点为6.6。

一种黄芩蛋白的提取方法，经过磷酸盐缓冲液水相抽提，离子交换色谱DEAE、High-S，从黄芩中药饮片中分离得到一个电泳纯的黄芩蛋白。

其具体包括以下步骤：

1）黄芩蛋白粗提液的制备：黄芩饮片经高速粉碎机粉碎，以质量比1:10将黄芩粉末和0.1mol/L、pH7.5的磷酸缓冲液混合均匀，置于4℃，搅拌浸提12 h；用3层纱布过滤得到黄芩浸提液，随后弃去滤渣，将滤液在4 ℃下经12000g离心15min，收集上清液；在4℃磁力搅拌条件下，向黄芩蛋白抽提液中缓慢加入无水硫酸铵，使溶液盐浓度达到20%，待完全溶解后，4℃下静置1 h，以12000rpm离心15min，收集上清液；继续向收集的上清液中缓慢加入无水硫酸铵至饱和度为40%，待完全溶解后，于之前同样步骤收集上清液；继续向上清液加入硫酸铵至饱和度为60%，待固体全溶后， 4 ℃下放置1 h，12000rpm离心15 min，收集沉淀。沉淀用0.1 mol/L、pH7.5Tris-盐酸缓冲液充分溶解后以相同浓度pH7.0Tris-盐酸缓冲液透析12h，将透析液在12000 rpm，4℃条件下，离心10 min，收集上清液，得到的溶液即为黄芩蛋白粗提液。

2）黄芩蛋白的离子交换色谱二步分离：