[发明专利]一种黄芩蛋白纳米颗粒及其制备方法

权利要求书

1.一种黄芩蛋白，其特征在于：所述黄芩蛋白的N-端一级结构序列为SAVXSKSPEY；

所述蛋白的制备方法，具体包括以下步骤：

1）黄芩蛋白粗提液的制备：黄芩饮片经高速粉碎机粉碎，以质量比1:10将黄芩粉末和0.1mol/L、pH7.5的磷酸缓冲液混合均匀，置于4℃，搅拌浸提12h；用3层纱布过滤得到黄芩浸提液，随后弃去滤渣，将滤液在4℃下经12000g离心15min，收集上清液；在4℃磁力搅拌条件下，向上清液中缓慢加入无水硫酸铵，使溶液盐浓度达到20%，待完全溶解后，4℃下静置1h，以12000rpm离心15min，收集上清液；继续向收集的上清液中缓慢加入无水硫酸铵至饱和度为40%，待完全溶解后，于之前同样步骤收集上清液；继续向上清液加入硫酸铵至饱和度为60%，待固体全溶后，4 ℃下放置1 h，12000rpm离心15 min，收集沉淀；沉淀用0.1 mol/L、pH7.5Tris-盐酸缓冲液充分溶解后以相同浓度pH7.0 Tris-盐酸缓冲液透析12h，将透析液在12000 rpm，4℃条件下，离心10 min，收集上清液，得到的溶液即为黄芩蛋白粗提液；

2）黄芩蛋白离子交换色谱二步分离：

a.将50 mL黄芩蛋白粗提液加至以0.01 mol/L、pH7.0 Tris-盐酸缓冲液平衡常压液相弱阴离子交换色谱DEAE色谱柱，以同样浓度Tris-盐酸缓冲液继续平衡3倍柱体积后，再以含0～1 mol/L NaCl的0.01 mol/L、pH7.0Tris-盐酸缓冲液线性梯度洗脱250 mL，最后用含1 mol/L NaCl 的0.01 mol/L、pH7.0 Tris-盐酸缓冲液洗脱1个柱体积，流速1 mL/min，紫外分光光度计测量波长为280 nm，经过色谱分离的组分以自动分布收集仪收集，后以SDS-PAGE进行蛋白成分鉴定；

b.将经DEAE分离且透析过的蛋白组分进一步用Macro-Prep® High-S色谱柱进行分离，取60ml经DEAE分离且透析过的蛋白组分加至以0.02 mol/L、pH5.0 Tris-盐酸缓冲液平衡Macro-Prep® High-S色谱柱，以同样浓度Tris-盐酸缓冲液继续平衡3倍柱体积后，再以含0～1 mol/L NaCl的0.02 mol/L、pH5.0Tris-盐酸缓冲液线性梯度洗脱250 mL，最后用含1 mol/L NaCl 的0.02 mol/L、pH5.0 Tris-盐酸缓冲液洗脱1个柱体积，流速1 mL/min，紫外分光光度计测量波长为280 nm，经过色谱分离的组分以自动分布收集仪收集，后以SDS-PAGE进行蛋白成分鉴定；

3）黄芩蛋白的基本性质表征：以SDS-PAGE测定该经纯化得到的黄芩蛋白的分子量大小，以等点聚焦测定该黄芩蛋白的等电点，以Edman degradation测定该黄芩蛋白的N-端一级结构序列，所述的黄芩蛋白分子量为36.8kDa、等电点为6.6。

2.一种黄芩蛋白纳米颗粒，其特征在于：所述黄芩蛋白纳米颗粒由权利要求1中所述黄芩蛋白组成，19个黄芩蛋白单体形成一个类球状体的蛋白纳米颗粒，该纳米颗粒其平均粒径为85.6±2.8 nm，表面电荷呈负性，范围在-21±3mV。

3.一种如权利要求2所述的一种黄芩蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括：将该黄芩蛋白配制为1 mg/mL的pH 7.5盐溶液，经过80-100℃加热1小时，利用分子截留量为100 kDa的超滤离心管进行超滤去除未反应的黄芩蛋白，即获得黄芩蛋白纳米颗粒。

4.根据权利要求3所述的一种黄芩蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述的盐溶液为Tris-盐酸溶液或磷酸盐溶液。