[发明专利]一种肿节风SCAR分子鉴定标记的克隆与验证方法

说明书

技术领域

本发明涉及中药鉴别技术领域，具体是一种肿节风SCAR分子鉴定标记的克隆与验证方法。

背景技术

肿节风（又名草珊瑚、九节茶、接骨木、接骨金粟兰、九接风等）为常用中药，系金粟兰科（Chloranthaceae）草珊瑚属植物草珊瑚（Sarcandra glabra（Thunb.）Nakai）的全草。2010版《中华人民共和国药典》收载其作为法定药材，同时以肿节风为原料的肿节风片、血康口服液、万通炎康片及提取物肿节风浸膏也已收入 2010 版药典，肿节风注射液、新癀片、消炎片、三蛇胆川贝液均收入部颁药品标准中。

肿节风作为我国传统的中药材，历来受到广泛的关注和研究，对肿节风的相关研究主要集中在化学成分、药理活性和临床应用等方面。研究表明，肿节风具有抗菌、抗辐射、抗肿瘤、促进骨折愈合及镇痛等多种活性，且肿节风及其提取物具有较好的安全性，急性毒性试验结果属实际无毒，动物精子畸形试验、小鼠骨髓细胞微核试验，未发现致突变。近年来发现，肿节风可用于治疗肿瘤（胰腺癌、胃癌、直肠癌、肝癌、食道癌等），且有较显著效果。

作为重要的传统中药，市场上已出现了金粟兰、鸡爪兰、及己等与肿节风功效不尽相同的非药典收载的混淆品，严重影响着肿节风的临床应用，造成了用药安全问题。目前，对中药材鉴定的方法主要有性状鉴别、显微鉴别和理化鉴别，虽国内外已报道应用中药分子鉴定方法从基因分子水平对中药材进行鉴定，如中国专利201510515936.2鉴别草珊瑚与3 种混淆品的分子特异性标记引物及方法，通过对草珊瑚、金粟兰、宽叶金粟兰和及己的 trnL-F 区序列进行测序，分析其序列结构和特征，寻找单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism SNP) 分子标记，设计分别识别草珊瑚，金粟兰，宽叶金粟兰和及己的特异识别引物，建立多重PCR 技术，可快速简单鉴别草珊瑚与金粟兰、宽叶金粟兰和及己3 种混淆品的方法。但此方法较适用于干燥及加工后的产品鉴定，且提取的DNA不够完整，鉴别的范围较窄。

SCAR（Sequence characterized amplified region，特征性扩增片段区域）分子标记是研究对象基因组中特定序列的DNA分子，找到SCAR分子标记，并获得它的序列，就可以根据序列设计特异性引物，对研究对象实现特异性PCR分子鉴定方法。但药用植物因其自身次生代谢物较复杂，提取基因组DNA相对较为困难，若其中的次生代谢物不能有效去除，必将会影响到后续的PCR扩增。

发明内容

基于此，本发明提供了一种肿节风SCAR分子鉴定标记的克隆与验证方法，目的是寻找简单、可重复的分子鉴定方法对传统中药肿节风进行鉴定，以期区分其混淆品，保证用药安全。

一种肿节风SCAR分子鉴定标记的克隆与验证方法，方法包括以下内容

1、采用改良CTAB法提取肿节风基因组DNA，具体包括以下步骤：

（1）称取肿节风细嫩叶片0.5 g，剪碎放入预冷研钵中，液氮条件下研磨成均匀细粉状迅速转移至15 mL离心管；

（2）加入65 ℃预热的1.5×CTAB提取缓冲液及β-巯基乙醇，上下颠倒混匀后，65 ℃水浴30 min，每10min取出摇匀一次，冷却至室温，12000 r/min离心10 min；

（3）吸取上清，加入等体积氯仿/异戊醇（24：1），轻缓上下颠倒混匀，12000 r/min离心10 min，小心吸取上清液，加1/l0体积1×CTAB提取缓冲液和等体积的氯仿/异戊醇(24：1)，轻缓上下颠倒混匀，12000 r/min离心10 min；

（4）小心吸取上清液，加入等体积1×CTAB沉淀缓冲液，轻缓摇匀，65 ℃水浴30 min，12000 r/min离心10 min，弃上清液，加1 mol/LNaC1溶解沉淀，12000 r/min离心10 min，吸取上清液转移至1.5 mL EP管，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，轻缓摇匀，可见白色絮状物聚集，-20 ℃静置15 min，12000 r/min离心5 min，小心倒掉上清液，70％乙醇漂洗沉淀，12000 r/min离心10 min，弃上清液，自然风干后加三蒸水溶解沉淀，-20 ℃保存。

2、基因组DNA质量检测