[发明专利]一种肿节风SCAR分子鉴定标记的克隆与验证方法

权利要求书

1.一种肿节风SCAR分子鉴定标记的克隆与验证方法，其特征在于，所述方法包括以下内容：

（1）肿节风基因组DNA 提取；

（2）基因组DNA质量检测；

（3）肿节风基因组DNA进行RAPD扩增；

（4）肿节风SCAR分子标记的胶回收；

（5）肿节风SCAR分子标记的克隆及鉴定；

（6）肿节风SCAR分子标记的测序；

（7）肿节风鉴定特异性引物的设计；

（8）肿节风SCAR分子标记特异引物的验证。

2.根据权利要求1所述肿节风SCAR分子鉴定标记的克隆与验证方法，其特征在于，所述肿节风基因组DNA 提取是采用改良CTAB法提取肿节风的基因组DNA，具体包括以下步骤：

（1）称取肿节风细嫩叶片0.5 g，剪碎放入预冷研钵中，液氮条件下研磨成均匀细粉状迅速转移至15 mL离心管；

（2）加入65 ℃预热的1.5×CTAB提取缓冲液及β-巯基乙醇，上下颠倒混匀后，65 ℃水浴30 min，每10min取出摇匀一次，冷却至室温，12000 r/min离心10 min；

（3）吸取上清，加入等体积氯仿/异戊醇，轻缓上下颠倒混匀，12000 r/min离心10 min，小心吸取上清液，加1/l0体积1×CTAB提取缓冲液和等体积的氯仿/异戊醇，轻缓上下颠倒混匀，12000 r/min离心10 min；

（4）小心吸取上清液，加入等体积1×CTAB沉淀缓冲液，轻缓摇匀，65 ℃水浴30 min，12000 r/min离心10 min，弃上清液，加1 mol/LNaC1溶解沉淀，12000 r/min离心10 min，吸取上清液转移至1.5 mL EP管，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，轻缓摇匀，可见白色絮状物聚集，-20 ℃静置15 min，12000 r/min离心5 min，小心倒掉上清液，70％乙醇漂洗沉淀，12000 r/min离心10 min，弃上清液，自然风干后加三蒸水溶解沉淀，-20 ℃保存。

3.根据权利要求1所述肿节风SCAR分子鉴定标记的克隆与验证方法，其特征在于，所述基因组DNA质量检测包括以下内容：

取适量 DNA提取液上样于1％琼脂糖凝胶，电泳缓冲液：1×TAE，电压100 V，电泳15 min，凝胶成像系统观察并拍照；用微量核酸蛋白分析仪对其浓度及纯度进行测定，每份样品平行三次，读取其A₂₆₀及A₂₆₀/A₂₈₀。

4.根据权利要求1所述肿节风SCAR分子鉴定标记的克隆与验证方法，其特征在于，所述肿节风基因组DNA进行RAPD扩增包括以下内容：

（1）从随机引物库中挑选了45条进行单一引物PCR扩增，扩增体系和扩增程序按如下规定：

1）扩增体系：10×Buffer，2.0 mmoL/L Mg²⁺，2.5 mmoL/L dNTPs，25 mg/mL BSA，10 μmoL/L随机引物，模板DNA，5.0 U/L rTaq DNA 聚合酶，三蒸水补至25 μL；

2）扩增程序：94 ℃预变性30 s，然后94 ℃变性30 s、36 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min进行35个循环，最后72 ℃延伸10 min；

（2）PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察并拍照。