[发明专利]高产左旋内酯水解酶的黑曲霉菌株BFA010-7及其在制备D-泛解酸内酯中的应用

说明书

本发明公开了一种经土壤筛选和低温等离子体诱变所获得的高产D‑泛解酸内酯酶的黑霉菌BFA010‑7，保藏编号为CGMCC 14631，以及上述黑曲霉菌株BFA010‑7在制备D‑泛解酸内酯中的应用。本发明中，黑曲霉菌丝体通过包埋方式在海绵块中生长繁殖，然后通过化学交联法制备获得固定化细胞催化剂，整个工艺简便易行、廉价实用、易于放大。制备所得的固定化细胞催化剂具有活性高、操作稳定性好以及易于分离回收等优点，在D‑泛酸钙工业生产过程中具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，更具体的涉及一种D-泛解酸内酯酶高产菌株的土壤筛选和诱变育种，诱变菌株的发酵培养和细胞固定化，以及固定化细胞在生物水解制备光学活性D-泛解酸内酯中的应用。

背景技术

D-泛解酸内酯是合成D-泛醇、D-泛酸和D-泛酸钙的重要手性中间体。采用D-泛解酸内酯酶优先催化外消旋底物中D-泛解酸内酯的水解，收集水解所得的D-泛解酸，经酸化和加热即可转变成高光学纯度的D-泛解酸内酯。具有高活性、高选择性与高稳定性的D-内酯水解酶催化剂，是高效、低成本地生产D-泛解酸内酯及其衍生产品的核心技术要素。

在现有的科技论文和专利文献中，公开了大量表达D-泛解酸内酯酶的微生物菌株(例如CN100351369C,CN102229894B)，其中高产D- 泛解酸内酯酶的微生物菌株分别属于镰孢霉菌、赤霉菌、泡盛曲霉以及番茄织球壳菌，这些微生物大部分都是植物致病菌，用这些菌株进行D-泛解酸内酯酶的发酵生产及催化反应不利于环境保护和人身安全。黑曲霉是国际公认的安全无害的微生物，已经广泛应用于生物饲料添加剂的生产，并可作为有益微生物直接用于饲料中。专利CN 100351369C中，虽然提及一些黑曲霉也能催化泛解酸内酯的水解，在相应的显色平板上产生显色圈，但是由于没有对黑曲霉进行进一步诱变育种，该专利中所公开的那些黑曲霉菌株的产酶活力并不高。如果对土壤分离的黑曲霉菌株进行大规模诱变和筛选，有可能获得生物安全而且高产D-泛解酸内酯酶的黑曲霉菌株。

迄今已报道的高产D-泛解酸内酯酶的微生物菌株大多是产菌丝体的真菌。反应器中菌丝体的生长对搅拌产生的剪切力比较敏感，如果搅拌转速过高，不仅会造成菌丝体断裂，严重影响菌丝体的过滤分离过程，而且酶的产量也会受到严重影响(江南大学硕士学位论文，微生物酶法拆分制备D-泛解酸内酯，2001年)。由于菌丝体细胞本身很容易通过过滤等方式进行分离，在发酵液中直接加入戊二醛，对菌丝体细胞以及胞内的酶进行交联固定化是一种快速高效的固定化方法，制备所得的固定化细胞具有稳定性高、易于分离的优点(Enzyme and Microbial Technology,2004,35:161–166)。尽管如此，固定化菌丝体细胞在应用时，反应液粘度高、传质差，并且在长时间使用后，由于菌丝体的断裂，会导致固定化细胞的分离回收困难。专利CN 101343627A公开了串珠镰孢霉菌固体发酵生产D-泛解酸内酯酶的方法，解决了液体发酵过程中搅拌剪切力对菌丝体的影响，但该专利未公开菌丝体细胞的固定化方法。江苏省农科院报道了采用海绵对香菇菌丝体进行固定化培养的方法(食用菌，2001(1)：8-9)，如果将这种方法应用于D-泛解酸内酯酶的发酵生产中，菌丝体生长在海绵块的内部，可以有效地避免搅拌剪切力对菌丝体生长的影响，降低发酵液和反应液的粘度，有利于强化传质并且简化细胞的分离。

发明内容

1、发明目的。

本发明提供了一种生物安全且高产D-泛解酸内酯酶的黑曲霉菌株；进一步通过海绵固定化培养的方式，避免菌丝体与搅拌桨的直接接触，消除剪切力对丝状微生物生长的不利影响。

2、本发明所采用的技术方案。

本发明采用的技术方案之一：泛解酸内酯酶产生菌种的筛选