[发明专利]一种基因工程菌及其在生产D-1,2,4-丁三醇中的应用

说明书

本发明公开了一种基因工程菌及其在生产D‑1,2,4‑丁三醇中的应用。该基因工程菌为构建克隆表达2‑酮酸脱羧酶基因MdlC和木糖脱氢酶基因XylB,木糖酸脱水酶基因YjhG和醇脱氢酶基因YqhD,并将构建好的基因转入宿主菌BL21(DE3)的细胞内得基因工程菌BL21‑02,在此基因工程菌的基础上筛选新的木糖酸脱水酶，得到新的基因工程菌，经发酵培养生产D‑1,2,4‑丁三醇。本发明通过筛选所提供的木糖酸脱水酶基因CcXylD,能够提高D‑木糖合成D‑1,2,4‑丁三醇的能力。再将本发明中最适的木糖酸脱水酶基因CcXylD与来源于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）的α‑酮酸脱羧酶KdcA共同应用到D‑1,2,4‑丁三醇生产过程中，得到最优菌株BL21‑15,最终BT产量可达10.66g/L。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种基因工程菌及其在生产D-1,2,4-丁三醇中的应用。

背景技术

D-1,2,4-丁三醇 （简称BT）是一种四碳的多元醇，性质与甘油类似，广泛应用于医药、农药、化妆品、造纸、高分子材料、烟草、军工等领域。BT及其相关衍生物是许多天然产物合成中的重要底物，也是许多手性化合物的合成前体：军事上，由于BT的硝基化合物冲击敏感性低、热稳定性好、低毒性、吸湿性好，与其它含能增塑剂混合使用，可显著提高以硝化纤维素为基火药的低温力学性能。因此，BT常作为 1,2,4-丁三醇三硝酸酯 (BTTN) 的合成前体，后者可代替硝化甘油作为推进剂和含能增塑剂，并具有更优的理化性质。医药方面，BT可被用作阳离子脂质体和多种药物的合成前体，BT还可以用来制备降胆固醇类药Movinolin、抗癌药物 compatin、治疗皮肤病药物羟基二十碳四烯酸(12-HETE)及艾滋病药物 3-羟基-四氢呋喃。此外，BT 还可用作可消除硝基化合物对人体的毒害，减少焦油成分危害的卷烟添加剂，可用作高分子材料的交联剂，增加材料的强度和硬度，还可用作高级墨水 的防干剂、高级服装表面处理剂、陶瓷加工助剂、特殊用途包装与储运等。

目前工业上使用的 D-1,2,4-丁三醇都是由反应条件苛刻的化学法合成。自Wagner以3-丁烯醇为原料合成D-1,2,4-丁三醇以来，合成方法不断改进，先后有苹果酸还原法、丙烯醇法、2-丁烯-1,4-二醇的汞氧化水合法、2-丁烯-1,4-二醇的酸催化法、马来酸及其酯的氢化法、3-丁烯-1-醇的氧化水合法等。由于化学合成法存在反应条件苛刻、污染物排放严重等诸多缺点,部分研究者将目光转向更为经济和环保的生物合成技术。

2003 年，Niu等首先提出了BT的生物合成法。通过在大肠杆菌( Escherichia coli)中构建异源代谢途径，以 D-木糖或 L-阿拉伯糖为底物，经过四步酶催化实现。整个工艺使用了莓实假单胞菌 Pseudomonas fragi 和大肠杆菌 Escherichia coli 两种微生物作为催化剂。之后，研究者将BT 转化途径的四步酶都在 E. coli 中进行表达，用 E. coli 即可完成整个 BT 的生物转化，大大简化了转化工艺。但从目前已有报道来看，用重组 E. coli 生产 BT 的催化效率较低，导致 BT产量无法满足工业生产的需求。如果要进一步提高 BT 的转化效率，首先必须对 BT 合成途径进行系统地优化，找出催化限速步骤，精确调节催化各个步骤酶的表达量，以实现最大的转化通量。

发明内容

针对现有BT生物转化途径仍面临的效率低的问题，本发明考察了不同来源的木糖酸脱水酶和不同来源的2-酮酸脱羧酶。筛选得到最优的木糖酸脱水酶基因CcXylD和最优的α-酮酸脱羧酶基因KdcA，构建得到一株基因工程菌BL21-15，该菌株D-1,2,4-丁三醇产量较高，可达10.66g/L。