[发明专利]一种基因工程菌及其在生产D-1,2,4-丁三醇中的应用

权利要求书

1.一种基因工程菌，其特征在于，构建克隆表达α-酮酸脱羧酶基因KdcA、木糖脱氢酶基因XylB, 木糖酸脱水酶基因CcXylD和醇脱氢酶基因YqhD, 并将构建好的基因转入宿主菌细胞内得基因工程菌，所述基因工程菌用于发酵生产D-1,2,4-丁三醇；所述α-酮酸脱羧酶基因KdcA来源于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），GenBank: AAS49166.1；所述木糖酸脱水酶基因CcXylD来源于新月柄杆菌（Caulobacter crescentus），基因序列如SEQ.NO.1所示；所述木糖脱氢酶基因XylB，Gene ID: 7329904；所述醇脱氢酶基因YqhD，GenBank:ADK47404.1；宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

2.权利要求1所述基因工程菌的构建方法,其特征在于：包括如下步骤：

步骤1，构建克隆表达α-酮酸脱羧酶基因KdcA和木糖脱氢酶基因XylB,木糖酸脱水酶基因CcXylD和醇脱氢酶基因YqhD；

步骤2，KdcA基因被插入质粒pTRC99a 的NcoⅠ和Sac Ⅰ位点之间，得到质粒pTRC-KdcA,XylB基因被插入质粒pTRC99a 的NcoⅠ和BamHⅠ位点之间，从而获得pTRC99a-XylB；然后通过PCR得到带有TRC启动子的XylB片段，将该片段插入质粒pTRC-KdcA的Sac Ⅰ和BamH Ⅰ位点之间，得到质粒pTRC-KdcA-TRC-XylB；

步骤3，将基因片段CcXylD、YqhD分别插入pCWJ质粒，得到重组质粒 pCWJ-CcXylD和pCWJ-YqhD；以pCWJ-YqhD质粒为模板扩增出带有TRC启动子的YqhD片段，将片段插入质粒pCWJ-CcXylD，得到质粒pCWJ-CcXylD-TRC-YqhD；

步骤4，将质粒pTRC-KdcA-TRC-XylB和质粒pCWJ-CcXylD-TRC-YqhD共同转入宿主菌BL21（DE3）细胞内得基因工程菌BL21-15。

3.权利要求1所述的基因工程菌在发酵生产D-1,2,4-丁三醇中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将基因工程菌接种至发酵培养基中，加入IPTG诱导发酵得产物D-1,2,4-丁三醇。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基为: 蛋白胨 10g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 10 g/L， D-木糖 25g/L ，氨苄霉素100 mg/L, 氯霉素 68 mg/L 。

6.根据权利要求4所述的应用,其特征在于，发酵温度为30~37℃，发酵时间为60~72h。