[发明专利]基于微孔板的雨生红球藻筛选方法

说明书

本发明属于微生物的筛选方法，特别是指一种基于微孔板的雨生红球藻筛选方法。包括种子培养、发酵培养、促使虾青素积累、虾青素的提取、雨生红球藻的筛选等工艺步骤，各步骤中的微孔板选用透光材质制作。本发明有效解决了现有微孔板法高通量筛选雨生红球藻时存在培养困难、虾青素提取测定步骤繁琐且结果误差大、筛选结果不可靠的问题，具有与摇瓶筛选相比提高了培养效率、操作简单、有效减少乃至消除了微孔板培养雨生红球藻时因气体交换能力差造成孔板培养的边缘效应等优点。

技术领域

本发明属于微生物的筛选方法，特别是指一种基于微孔板的雨生红球藻筛选方法。

背景技术

虾青素是一种红色的类胡萝卜素，化学名称为3，3’-二羟基-4，4’-二酮基-β，β’-胡萝卜素，具有极强抗氧化功能的生物活性成分，研究发现其抗氧化活性比其他类胡萝卜素高10倍，比维生素E高550倍。虾青素能够增强机体免疫力，预防癌症，防止皮肤衰老，维护眼睛及中枢神经系统的健康，具有防治心血管疾病的功能，虾青素还具有很强的着色功能。目前虾青素主要来源有化学合成和天然资源，与化学合成的虾青素相比天然虾青素更容易被人体吸收、安全性高，其在食品、保健品、制药业、化妆品等行业均有广泛应用。

天然虾青素的生物来源主要有四种：一是从甲壳类动物中直接提取获得；二是某些细菌(如乳酸分支杆菌、短杆菌等)合成的虾青素；三是利用某些真菌(如红法夫酵母)生产虾青素；四是利用微藻(如衣藻、小球藻和雨生红球藻等)生产虾青素。雨生红球藻细胞内积累的虾青素占类胡萝卜素总量的90％以上，含量可达到藻体干重的4％，被确认为自然界中虾青素含量最高、最可能实现工业化生产的物种。虽然雨生红球藻是公认的天然虾青素的最佳来源，但由于受到其生长速率慢，发酵周期长，虾青素含量和产率低，培养过程中易受细菌、杂藻及原生动物污染等不利因素的影响，制约了其工业化的生产。因而选育优良高产的雨生红球藻藻种对虾青素工业化生产具有重大意义。目前雨生红球藻的育种工作多采用自然筛选和诱变育种两种方法，以生长速率、生物量及虾青素含量等指标作为筛选依据进行优良藻株的选育。一般来说，菌种变异都是随机的，经过一次的诱变和筛选很难筛选到所需的藻株，需要经过多轮诱变，从成百上千甚至是上万的藻株中去挑选遗传稳定的高产藻株，巨大的工作量给筛选工作带来困难。

常规的筛选方法是将待筛选的藻种接种于摇瓶培养，定时取样测定生长状况，培养到一定时期后对藻种进行刺激促进虾青素的积累，虾青素积累完成后离心收集细胞，提取和测定虾青素。由于雨生红球藻的生长特性和细胞形态的特点，使得摇瓶筛选方式存在两个难点。一是因为雨生红球藻的培养分两个阶段，在第一阶段先将细胞培养至对数末期，第二阶段时再改变培养条件促进虾青素积累，所以在培养过程中需要不断取样测定细胞生长时期，而逐个摇瓶取样和测定使得操作非常繁琐，对于大批量的筛选费时费力很难完成；二是雨生红球藻生长到后期会形成厚壁孢子，导致虾青素提取和测定非常困难。因为较厚的细胞壁阻碍了溶剂渗透和虾青素的胞外扩散，所以虾青素提取过程中还需要逐个对样品进行破壁处理，导致整个筛选过程工作量大且耗时长。因此雨生红球藻的筛选工作需要一种高效的培养方法和虾青素提取测定方法。