[发明专利]基于微孔板的雨生红球藻筛选方法

权利要求书

1.基于微孔板的雨生红球藻筛选方法，其特征在于包括如下工艺步骤：

A、种子培养：将藻种接入微孔板内灭菌后的种子液培养基中，光照静置培养至藻种处于对数期获得种子液；

B、发酵培养：将步骤A中制备的种子液接入微孔板内灭菌后的发酵培养基中，光照静置培养至藻种处于对数末期获得发酵液；

C、促使虾青素积累：调整发酵液的培养条件促使虾青素积累；

D、虾青素的提取：虾青素积累完成后向微孔板内加入虾青素提取介质后混匀进行超声处理，超声处理的条件为：先在超声频率为25KHz-50KHz的条件下处理20-60分钟，再在超声频率为70KHz-200KHz条件下处理10-40分钟；

E、雨生红球藻的筛选：测定步骤D中产物的虾青素含量，依据虾青素含量测定结果筛选高产虾青素的雨生红球藻；

步骤A中的种子液培养基包括如下原料：

硝酸钠100mg/L-300mg/L；磷酸二氢钾50mg/L-250mg/L；磷酸氢二钾50mg/L-150mg/L；七水合硫酸镁50mg/L-150mg/L；二水合氯化钙10mg/L-80mg/L；乙二胺四乙酸二钠10mg/L-100mg/L；柠檬酸铁铵2mg/L-10mg/L及微量元素；微量元素包括含量均为0.05μM的钴盐、铜盐、钼盐、镍盐、碘盐，含量均为0.01μM的钒盐、钨盐、铬盐，含量均为0.1μM的锌盐和1.0μM的锰盐；种子液培养基的pH=6.8；

各步骤中的微孔板选用透光材质制作，步骤A、B中光照静置培养条件为温度20℃-28℃，光照强度600lux-900lux，步骤A、B中光照静置培养条件为湿度不低于96%；

步骤A、B中的种子液培养基及发酵培养基中含有如下原料：

异抗坏血酸钠0.1g/L-0.5g/L；半胱氨酸盐酸盐0.6g/L-1.6g/L；抗坏血酸钠0.2g/L-0.8g/L；

步骤B中的发酵培养基包括如下原料：

三水合醋酸钠1g/L-3g/L；硝酸钠0.4g/L-1.6g/L；谷氨酸钠0.1g/L-1g/L；六水合氯化镁0.05g/L-0.8g/L；柠檬酸铁铵2mg/L-10mg/L；二水合氯化钙0.01g/L-0.05g/L；碳酸钠0.1g/L-0.8g/L及微量元素；微量元素包括含量均为0.05μM的钴盐、铜盐、钼盐、镍盐、碘盐；含量均为0.01μM的钒盐、钨盐、铬盐；0.1μM的锌盐和1.0μM的锰盐；发酵培养基的pH=6.8；

步骤C中调整后发酵液的培养条件为温度22℃-26℃，湿度不低于96%；步骤C中调整后发酵液的培养条件是采用在微孔板的孔内加入促进剂或进行光照培养中的一种或其结合的技术手段促使虾青素积累，促进剂选用终浓度为1.5g/L-6g/L的醋酸钠、0.3g/L-0.7g/L的七水合硫酸亚铁、5g/L-10g/L的氯化钠中的一种或其结合，光照强度为8000lux-10000lux；

步骤D中的虾青素提取介质选用二甲基亚砜，二甲基亚砜的加入量为培养液体积的1-3倍；

步骤E中测定虾青素含量时虾青素浓度为12mg/L-160mg/L。

2.根据权利要求1所述的基于微孔板的雨生红球藻筛选方法，其特征在于微孔板选用48孔板、24孔板、12孔板或6孔板中的一种，微孔板的材质选用聚苯乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚氯乙烯中的一种。

3.根据权利要求1或2所述的基于微孔板的雨生红球藻筛选方法，其特征在于微孔板的材质选用聚丙烯。

4.根据权利要求1所述的基于微孔板的雨生红球藻筛选方法，其特征在于步骤A中藻种的接种量按体积比为8%-20%。

5.根据权利要求1所述的基于微孔板的雨生红球藻筛选方法，其特征在于步骤A中的种子培养的级数为至少一级。

6.根据权利要求5所述的基于微孔板的雨生红球藻筛选方法，其特征在于步骤A中的种子培养的级数为两级。

7.根据权利要求1所述的基于微孔板的雨生红球藻筛选方法，其特征在于步骤B中藻种的接种量按体积比为8%-15%。