[发明专利]一种三维肿瘤模型脱细胞多孔支架、构建方法及其应用

说明书

本发明属于细胞生物学及肿瘤组织工程材料领域，提供一种三维肿瘤模型脱细胞多孔支架、构建方法及其应用。将整个猪肺支架预冻，选取无明显支气管且均匀部位切块，加入纯净水及PBS清洗至无血丝，用十二烷基磺酸钠及TritonX‑100去除细胞，采用冷冻干燥、化学交联法获得交联的脱细胞猪肺三维肿瘤模型支架。本发明采用猪肺组织来源的脱细胞基质作为构建肿瘤模型的支架材料，在有效去除细胞成分的基础上，尽可能地保留肺泡‐支气管结构脉络网，可模拟天然胞外基质微环境，利于细胞黏附、生长和增殖。经接种细胞后体外构建的三维肿瘤模型，其组织结构更接近在体组织，适用于抗癌药物的筛选研究。

技术领域

本发明属于细胞生物学及肿瘤组织工程材料领域，提供一种三维肿瘤模型脱细胞多孔支架、构建方法及其应用。

背景技术

恶性肿瘤作为全球较大的公共卫生问题之一，已成为一种严重危害人类健康的常见病、多发病，我国面临的形势也越发严峻。随着肿瘤靶点及抗癌药物的不断发现，选择真实模拟体内肿瘤组织的模型是筛选有效抗癌药物的重要手段。临床试验是研究肿瘤及药物筛选最有效的途径，但安全因素及伦理问题使其得不到广泛应用。动物移植性肿瘤模型是当前主要的药筛模型之一，其能提供局部组织的微环境，形成的肿瘤更接近在体肿瘤组织，药物筛选结果更可靠，但其弊端是实验周期较长、价格较高，且存在动物伦理问题。传统细胞二维培养模型仍是目前大多数肿瘤研究的主要方法，然而由于缺乏三维环境下细胞及胞外基质之间的相互作用，肿瘤细胞在形态及功能方面都发生了一定改变，不能真实地反映体内肿瘤的微环境，使得影响基因和蛋白表达及细胞增殖分化的细胞间相互作用发生改变，缺乏生理相关性。另外，二维培养体系无法反映肿瘤组织的高度复杂性和生物学特性，不能准确预测药物的抗癌作用。

实体肿瘤在体内以三维模式生长，其发生发展过程是肿瘤细胞与其微环境及机体之间不断相互作用的结果。肿瘤微环境是影响细胞分泌、粘附、增殖分化、侵袭和转移等生物学行为的重要因素。体外3D肿瘤模型能够在体外构建与体内相近的细胞生长系统，较好地提供肿瘤细胞生长的三维空间结构及模拟细胞生长的微环境，体现肿瘤细胞与细胞外基质(ECM)之间的相互作用。因此，体外构建的三维肿瘤模型受到了越来越多研究者的青睐，用于肿瘤细胞生物学行为及抗癌药物筛选的研究。

目前，组织工程技术已逐步用于构建体外三维肿瘤模型，研究结果表明肿瘤细胞接种于支架材料后形成的三维结构能够比二维平面更好模拟体内肿瘤组织，特别是模拟细胞间及细胞-胞外基质间相互作用。其中使用的支架材料多为天然材料和高分子合成材料，高分子合成材料在降解性能及可塑性方面基本能满足支架材料的要求，但是其生物相容性远不如天然材料，而天然材料弊端主要在于机械性能差，多需要与其他材料复合。器官/组织来源的脱细胞基质生物材料因能直接保留天然胞外基质微环境被逐渐应用在生物医学领域。其主要是利用脱细胞技术去除组织/器官中的细胞成分和遗传物质，尽可能的保留原ECM成分、生物活性及机械性能，去细胞后拥有良好的结构脉络网，为细胞提供了理想的生长环境。其中，猪源性肺组织在生理结构及基因组学等方面与人体肺相似。脱细胞猪肺基质不仅包含多种蛋白如胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白及蛋白多糖等，且其特有的肺泡及支气管结构为细胞生长及增殖提供了良好的三维空间。现有技术公布的脱细胞猪肺支架多用于构建组织工程肺，为肺移植治疗提供供体，且其去细胞化过程大都采用灌注法，借助肺组织的脉络循环清除所有的细胞成分。这种方法多需要蠕动泵等提供压力导入去细胞试剂，并且脱细胞试剂需求量大。另外，目前脱细胞肺支架主要用于替代损伤肺器官，脱细胞针对整个肺组织、脱细胞过程及再次注入细胞过程都需要保证完全无菌，操作缺乏灵活性。

本发明以猪源性肺脏组织为研究对象，选取均匀且无大支气管的区域切块，直接采用十二烷基磺酸钠及TritonX-100去除细胞成分，冷冻干燥后得到多孔的三维肿瘤模型支架。在此基础上，通过化学交联法以改善支架的稳定性和机械性能。本发明获得的脱细胞猪肺支架用于体外3D肿瘤模型的构建，表现出良好的生物相容性，支架上细胞呈现的生长模式与人体内实体瘤更加接近，适用于抗癌药物的筛选研究。

发明内容