[发明专利]一种split-TEV-Fast系统的构建方法及其在检测蛋白相互作用中的应用

说明书

本发明公开了一种基于酿酒酵母的split‑TEV‑Fast系统方法及其在检测蛋白互作中的应用，包括：1)构建载体pESD‑PPI，其含受半乳糖诱导的一个正向启动子和一个双向启动子，所述正向启动子用以表达TEV‑Fast蛋白酶底物与FLAG和HA标签序列，所述双向启动子用以表达拆分的TEV‑Fast蛋白酶和待测目的蛋白；2)用半乳糖同时诱导启动子，引发下游基因等量表达；3)利用分别识别FLAG和HA标签序列的荧光抗体对细胞进行标记；4)利用流式细胞仪检测细胞表面荧光信号，根据单双荧光信号判断蛋白之间相互作用的强度。本发明在TEV‑Fast蛋白酶及其底物‑COOH端使用不同强度的内质网滞留信号肽，可扩大检测蛋白互作的范围，并根据最终检测的单双荧光信号强度的比例分析蛋白互作的强弱。

技术领域

本发明属于生物技术和分子生物学技术领域，尤其涉及一种split-TEV-Fast系统的构建方法及其在检测蛋白-蛋白相互作用中的应用。

背景技术

研究蛋白-蛋白相互作用在诸多生物学领域中都具有极其重要的价值。在生物体内，一种蛋白质通常是与其他蛋白质发生相互作用来进一步执行其功能，是生物信息调控的主要方式，蛋白-蛋白相互作用阐明了整个细胞内的生理生化反应及分子机理，乃至细胞的整个生命过程。目前，验证蛋白-蛋白相互作用的方法主要包括几个经典的实验技术：酵母双杂交技术，免疫共沉淀技术(Co-IP)，GST pull down技术等等。酵母双杂交技术的特点在于敏感、高效、操作简易可大规模的进行验证，在实际应用当中，由于酵母双杂交的敏感性而伴随着一定的假阳性，同时由于反应发生在细胞核内，所以也并非适用于所有的蛋白质，从而可应用Co-IP，GST pull down技术对初筛结果进行进一步的补充，但是Co-IP使用免疫标签会有假阳性互作，GST pull down需要体外表达纯化蛋白，也有一定的局限性。

本发明建立了一种全新的研究蛋白-蛋白相互作用的技术——YeastEndoplasmic reticulum Sequestration based Split-TEV-Fast System(YES-STS,基于酵母内质网滞留的split-TEV-Fast蛋白酶系统)。TEV Protease(Tobacco etch virusprotease)是来源于烟草蚀纹病毒(TEV)的一种半胱氨酸蛋白酶，基于TEV蛋白酶的强底物特异性以及高活性，新近建立起一种可用于研究蛋白间相互作用的Split-TEV蛋白酶系统，引用于：[Wehr MC,Laage R,Bolz U,Fischer TM,Grunewald S,Scheek S,etal.Monitoring regulated protein-protein interactions using split TEV.Naturemethods.2006；3(12):985-93.]。Split-TEV以往所采用的均为野生型的TEV蛋白酶，在待测目的蛋白的相互作用下重新形成完整的TEV蛋白酶只保留其原有活性的40％，并且在细胞质中发挥作用，酶与底物作用空间大，浓度相对较低，造成反应灵敏度低，从而无法对蛋白互作强度进行准确定量。在本发明中，所用的TEV-Fast蛋白酶是经过蛋白酶工程、定向进化得到的一种高于野生型TEV蛋白酶活性接近4倍的突变体，其活性更高，反应更加灵敏，引用于[Yi,L.,Gebhard,M.C.,Li,Q.,Taft,J.M.,Georgiou,G.,and Iverson,B.L.“Engineering of TEV protease variants by yeast ER sequestration screening(YESS)of combinatorial libraries”,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2013；110(18):7229-34]。如图1所示，TEV-Fast蛋白酶从118位被分拆成独立的-NH₂端和-COOH端结构域，形成-NH₂端(1-118)和-COOH端(119-242)TEV-Fast，-NH₂端和-COOH端TEV-Fast结构域分别以接头(GGGGSGGGGS或V2R)与待测目的蛋白相连，在待测目的蛋白的相互作用下重新形成完整的TEV-Fast蛋白酶，从而切割底物。由于野生型TEV的活性较低，不足以使该系统发挥其灵敏性，故选用TEV突变体TEV-Fast，保证该系统灵敏高效的特点，这是本发明的第一个创新点。