[发明专利]一种split-TEV-Fast系统的构建方法及其在检测蛋白相互作用中的应用

权利要求书

1.一种spl it-TEV-Fast系统的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)构建载体pESD-PPI，所述载体pESD-PPI包含均受同一诱导剂诱导的一个正向启动子和一个双向启动子，所述正向启动子用以表达TEV-Fast蛋白酶的底物多肽和标签序列的对应的多肽，所述双向启动子用以表达拆分的TEV-Fast蛋白酶和待测的目的蛋白；(2)采用诱导剂诱导启动子，引发下游基因同时进行等量表达；(3)利用FLAG标签的荧光抗体和HA标签的荧光抗体对细胞进行荧光标记；(4)利用流式细胞仪检测细胞表面展示的单双荧光信号，再根据单双荧光信号的比例来判断蛋白与蛋白之间的相互作用的强度；所述步骤(1)中正向启动子为表达Aga2-FLAG-ENLYFQS-HA-ERS的GAL1，所述双向启动子为GAL1-GAL10，分别用以表达拆分的-NH2端TEV-Fast蛋白酶-目的蛋白A和-COOH端TEV-Fast蛋白酶-目的蛋白B，并使拆分的TEV-Fast和目的蛋白之间用接头连接。

2.根据权利要求1所述的spl it-TEV-Fast系统的构建方法，其特征在于，所述TEV-Fast蛋白酶为TEV蛋白酶的突变体。

3.根据权利要求1所述的spl it-TEV-Fast系统的构建方法，其特征在于，所述标签序列为FLAG标签和HA标签。

4.根据权利要求1所述的spl it-TEV-Fast系统的构建方法，其特征在于，所述ERS为内质网滞留信号肽；所述接头为GGGGSGGGGS或V2R。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的spl it-TEV-Fast系统的构建方法，其特征在于，在拆分的-COOH端和-NH2端TEV-Fast蛋白酶与目的蛋白融合体的COOH末端都分别加上不同强度的内质网滞留信号肽使得重构的TEV-Fast蛋白酶与底物的酶解反应发生在内质网内，并且作用不同的时间。

6.根据权利要求5所述的spl it-TEV-Fast系统的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(2)中的诱导剂为半乳糖。

7.根据权利要求6所述的split-TEV-Fast系统的构建方法，其特征在于，所述Aga2为酿酒酵母表面的α凝集素的结合亚单位，可与酵母表面的膜蛋白Aga1以二硫键结合展示于酵母表面，其中Aga1为α凝集素核心亚单位，在Aga2蛋白的牵引下，便可将底物多肽序列展示于细胞表面。

8.一种如权利要求1-7中任一项所述方法得到的split-TEV-Fast系统在检测蛋白是否相互作用和相互作用强度中的应用。