[发明专利]基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pygo2基因R356P突变的检测试剂

说明书

本发明公开了一种基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pygo2基因R356P突变的检测试剂、PCR检测方法及应用，检测试剂包括引物、肽核酸荧光探针及野生型互补的肽核酸序列，正向引物如序列表中SEQ ID NO.1、NO.3、NO.5、NO.7；反向引物如序列表中SEQ ID NO.2、NO.4、NO.6、NO.8；肽核酸荧光探针如序列表中SEQ ID NO.9、NO.10、NO.11、NO.12；野生型互补肽核酸序列如序列表中SEQ ID NO.13、NO.14、NO.15、NO.16。本发明从转录水平能快速发现Wnt信号通路中Pygo2基因的变情况，为抗癌药物筛选，新靶向药物探讨、基础科学研究提供工具。

本发明是《基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pygo2基因突变的检测试剂、PCR检测方法及应用》(专利申请号2015103553148，申请日20150624)的分案申请。

技术领域

本发明属于分子生物学生物核酸检测技术领域，具体涉及一种基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pygo2基因突变的检测试剂、PCR检测方法及应用。

背景技术

Wnt信号通路广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中，是一类在物种进化过程中高度保守的信号通路。Wnt信号在动物胚胎的早期发育、器官形成、组织再生和其它生理过程中，具有至关重要的作用。如果这条信号通路中的关键蛋白发生突变或者异常表达，导致信号异常活化，就可能诱导癌症的发生。Wnt信号通路包括经典的Wnt信号通路与非经典的Wnt信号通路，在经典通路即Wnt-β-catenin信号通路中，Wnt因子通过激活细胞膜上的Frizzle/LRP5/6协同受体后抑制细胞内游离β-catenin蛋白的磷酸化和降解，细胞质中的β-catenin蛋白水平升高后将发生β-catenin蛋白的核移位，导致细胞核中β-catenin蛋白升高，胞核中β-catenin蛋白能够联合Pygo2、Bcl-9以及FoxM1蛋白共同与TCF/LEF-1转录因子家族形成复合体并激活Wnt信号通路下游靶基因的转录激活。

Pygo2蛋白是Wnt信号通路中β-catenin下游重要成员之一，目前越来越多的研究已经发现，在很多肿瘤中Pygo2蛋白均呈现高表达。

目前研究核心信号通路的核心分子调控机制，以及某些重要成员在细胞中的表达水平，已经成为治疗肿瘤的一种关键手段，虽然近年来Wnt信号通路在癌症中的研究，以及Pygo2蛋白作为Wnt信号通路重要成员其表达水平的研究，已经成为研究开发肿瘤药物急需解决的重要问题，但是同时其在很多肿瘤细胞中基因的突变也越来越多，尤其是在Pygo2蛋白NHD端及PHD端发生的突变，对Pygo2蛋白发挥功能启动非常重要的作用，例如在膀胱癌细胞中检测出NHD端R46S突变，胰腺癌细胞中检测出P98H突变，肺腺癌细胞中检测出的PHD端R334Q突变以及急性骨髓性白血病中检测出的R356P突变。

肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)是一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA类似物。它是在第一代、第二代反义试剂的基础上，通过计算机设计构建并最终人工合成的第三代反义试剂，是一种全新的DNA类似物，即以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了DNA中的戊糖磷酸二酯键骨架，其余的与DNA相同，PNA可以通过Watson-Crick碱基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构。由于PNA不带负电荷，与DNA和RNA之间不存在静电斥力，因而结合的稳定性和特异性都大为提高；不同于DNA或DNA、RNA间的杂交，PNA与DNA或RNA的杂交几乎不受杂交体系盐浓度影响，与DNA或RNA分子的杂交能力远优于DNA/DNA或DNA/RNA，表现在很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力、不被核酸酶和蛋白酶水解。

发明内容

本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种能确定Wnt信号通路中核心的信号分子Pygo2基因突变情况，能解释核心分子Pygo2在肿瘤细胞中变化，结果重复性，敏感性好的基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pygo2基因R356P突变的检测试剂。