[发明专利]双环霉素生物合成中氧化酶的功能及其应用

说明书

本发明公开了双环霉素生物合成中氧化酶的功能及其应用，具体地，本发明提供了双环霉素合成中的六个氧化酶BcmB，BcmC，BcmD，BcmE，BcmF和BcmG，以及其用于催化以异亮氨酸‑亮氨酸环二肽(cIL)为初始底物的多步氧化反应，最终生成双环霉素的用途。本发明的方法可以应用于在体外以环二肽作为起始原料，高效生产双环霉素或其结构类似物。

技术领域

本发明属于生物技术和工程领域，具体地，本发明涉及双环霉素生物合成途径中几个氧化酶的功能及其应用。

背景技术

双环霉素是1972年由日本科学家从札幌链霉菌Streptomyces sapporonensis中分离得到的一种抗生素，它对很多革兰氏阴性菌和至少一种革兰氏阳性菌都具有杀菌作用。在临床上，双环霉素被用来治疗人的腹泻以及小牛和猪的细菌性痢疾、鱼类的假结核病，也被用于促进小鸡和猪的生长。最近的研究表明，当双环霉素与四环素、氯霉素、利福平等目前广泛使用的抗生素一起使用时，可以产生非常强的协同作用，大大提高这些抗生素的抗菌活性。双环霉素(图1)的结构非常特殊，与已知的其他种类的抗生素没有结构相似性，其结构可以分为三部分：[4,2,2]-双环骨架、C-1三羟基基团以及C5-C5a环外亚甲基，这使其抗菌的作用机制也与其他种类抗生素不同。双环霉素抗菌机制极其独特，被认为是目前已知的唯一一个来源于天然产物的转录终止因子Rho蛋白的选择性抑制剂。

从双环霉素被发现开始，很多有机合成化学家就对它的体外全合成产生了很大的兴趣，双环霉素最简单且立体专一性的有机化学全合成由Williams等在1984年完成，但是整个合成路线经过了12步，总产率很低。因此，我们在获得双环霉素生物合成基因的基础上，采用化学合成前体加体外酶催化合成的方式，建立了全新的双环霉素制备方法。与传统的有机全合成相比，体外酶催化全合成具有独特的优势：首先，酶的高效性使得酶催化合成中每一步反应的催化效率都比较高；其次，酶催化反应一般都具有非常好的立体选择性和区域选择性，这样在合成复杂的天然产物时就可以轻松的构建多个手性中心，得到单一构型的目标产物；再者，由于酶催化反应的特异性，进行体外酶催化全合成时，体系内副反应和副产物都比较少，所以酶催化全合成比较容易实现体外一锅法，进一步提高了反应的效率；另外，体外酶催化所需的反应条件相对比较温和，能源消耗较少，更加绿色环保。

综上所述，本领域迫切需要开发一种双环霉素的体外酶催化合成方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种双环霉素的体外酶催化合成方法。

在本发明的第一方面，提供了一种催化制备双环霉素(Biocyclomycin)的方法，所述方法包括步骤：

(i)在α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmE和任选的辅酶存在的条件下，用式I化合物进行反应，得到式II化合物；

(ii)在α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmC和任选的辅酶存在的条件下，用式II化合物反应，得到式III化合物；

(iii)在α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmG和任选的辅酶存在的条件下，用式III化合物反应，得到式IV化合物；

(iv)在α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmB和任选的辅酶存在的条件下，用式IV化合物反应，得到式V化合物；

(v)在辅酶和细胞色素P450单加氧酶BcmD存在的条件下，用式V化合物反应，得到式VI化合物；和

(vi)在α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmF和任选的辅酶存在的条件下，用式VI化合物反应，形成双环霉素(Biocyclomycin)：

在另一优选例中，所述的步骤(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)和(vi)在同一反应体系中进行。

在另一优选例中，所述的步骤(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)结束后，不分离产物，直接进行下一步反应。