[发明专利]双环霉素生物合成中氧化酶的功能及其应用

权利要求书

1.一种催化制备双环霉素的方法，其特征在于，包括步骤：

(i)在α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmE和任选的辅酶存在的条件下，用式I化合物进行反应，得到式II化合物；

(ii)在α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmC和任选的辅酶存在的条件下，用式II化合物反应，得到式III化合物；

(iii)在α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmG和任选的辅酶存在的条件下，用式III化合物反应，得到式IV化合物；

(iv)在α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmB和任选的辅酶存在的条件下，用式IV化合物反应，得到式V化合物；

(v)在辅酶和细胞色素P450单加氧酶BcmD存在的条件下，用式V化合物反应，得到式VI化合物；和

(vi)在α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmF和任选的辅酶存在的条件下，用式VI化合物反应，形成双环霉素：

；且

所述的α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmE的序列如SEQ ID NO：1所示；

所述的α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmC的序列如SEQ ID NO：3所示；

所述的α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmG的序列如SEQ ID NO：5所示；

所述的α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmB的序列如SEQ ID NO：7所示；

所述的α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmF的序列如SEQ ID NO：11所示；

所述的细胞色素P450单加氧酶BcmD的序列如SEQ ID NO：9所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmE、BcmC、BcmG、BcmB、BcmF和细胞色素P450单加氧酶BcmD来自于札幌链霉菌(Streptomyces sapporonensis)。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmE、BcmC、BcmG、BcmB、BcmF和/或细胞色素P450单加氧酶BcmD为在大肠杆菌中表达的重组蛋白。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)各自独立地在具有选自下组的一个或多个特征的反应体系中进行反应：

(a) α-酮戊二酸依赖的双加氧酶BcmE、BcmC、BcmG、BcmB、BcmF和细胞色素P450单加氧酶BcmD的单酶浓度为0.001-100mM；

(b) 反应体系的pH为6.0-9.0；

(c) 反应温度为15-45摄氏度；和

(d) 反应体系中，辅酶的浓度为0.01-100mM。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法在α-酮戊二酸存在下进行反应，且所述的α-酮戊二酸的浓度为0.01-100mM。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法在抗坏血酸存在下进行反应，且所述的抗坏血酸的浓度为0.01-100mM。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法在硫酸亚铁存在下进行反应，且所述的硫酸亚铁的浓度为0.01-100mM。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的反应体系中，各个底物的浓度分别为0.01-100mM。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的辅酶选自下组：NADPH，Ferredoxin，Ferredoxin Reductase，或其组合。