[发明专利]一种简便有效的细菌疫苗纯化方法

说明书

本发明在保证肺炎多糖免疫原性和符合欧洲药典各指标要求的前提下，提供了一套快速的、简化的肺炎链球菌发酵液纯化方法，用于制备精制的荚膜多糖。该方法通过改进裂解剂作用环境，控制发酵液的细菌密度、裂解剂浓度、添加裂解剂后的裂解时间，并调节pH到一定范围，可直接经离心、超滤等步骤后用乙醇沉淀多糖，即为精制多糖，取消了微滤、层析等步骤，去掉了CTAB、酶、苯酚等物料的添加，具有多糖收率高、过程简单快速、减少时间成本、人力成本和物料成本等优点。

技术领域

本发明涉及一种细菌疫苗的纯化方法，具体涉及一种细菌荚膜多糖的纯化方法。

背景技术

肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)是环境中常见的致病菌，5％～10％正常人上呼吸道中携带此菌。引起的疾病根据感染部位可分为侵袭性肺炎球菌疾病(Invasive Pneumococ-cal Disease，IPD)和非IPD(NIPD)。IPD包括脑膜炎、菌血症、脓毒症以及积脓症、心包炎、心内膜炎、腹膜炎和化脓性骨关节炎等；NIPD则主要包括：扁桃体咽炎、中耳炎、鼻窦炎等。

肺炎链球菌感染是在全球范围内引起死亡的重要原因之一，婴幼儿和65岁以上老年人发病率明显高于其他年龄组。全球每年有1200万的儿童因感染肺炎链球菌住院，160万幼儿死亡，在用疫苗可预防儿童死亡的疾病中，肺炎链球菌引起的疾病排名第一，随着抗菌素的大量使用，耐药菌株与日俱增，医学界肺炎疫苗的研发关注度逐渐提高。

1977年美国食品药品管理局批准了默沙东的14价肺炎球菌多糖疫苗上市，自此第一个正式的肺炎疫苗诞生，此后该类疫苗的生产改进和研发一直在多国进行，目前市场上常见且效果较好的是23价肺炎多糖疫苗和13价肺炎结合疫苗。肺炎链球菌的荚膜多糖是肺炎链球菌最重要的毒力因子，是血清学分型的依据，同时也是重要的保护性抗原，现有疫苗均是提取其荚膜多糖为原料制得。

荚膜多糖制备的一般工艺为：菌种制备、发酵培养、荚膜多糖纯化后制得精制多糖，目前肺炎菌体的培养大都能达到较高的菌体密度，而多糖纯化工艺，一直在研发、改进和提升中。

现有专利和文献所述的荚膜多糖纯化方式多种多样，且相同纯化方法也有处理顺序的不同，目前常见的关键处理步骤包括：直接(或加裂解剂后)离心或微滤去固体杂质，调pH(文献和专利出现最低pH为3.0)或用蛋白酶、核酸酶等处理去蛋白和核酸，加活性炭或者碘化钠进一步去除杂质，用CTAB或(一次或二次)乙醇沉淀荚膜多糖，再用苯酚抽提或层析法精制多糖等。我们在前人研究的基础上，通过反复的摸索，惊喜地发现了一套快速、简单、无人员毒害和环境污染的荚膜多糖纯化工艺技术，并且多糖经检验均符合欧洲药典标准。该方法能提高多糖收率以及生产效率、显著降低生产成本，有实际的经济和社会效益。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，在保证肺炎多糖免疫原性和符合欧洲药典各指标要求的前提下，提供一套快速的、简化的肺炎链球菌发酵液纯化方法，用于制备精制的荚膜多糖。该方法通过改进裂解剂作用环境，控制发酵液的细菌密度、裂解剂浓度、添加裂解剂后的裂解时间，并调节pH到一定范围，可直接经离心、超滤等步骤后用乙醇沉淀多糖，即为精制多糖，取消了微滤、层析等步骤，去掉了CTAB、酶、苯酚等物料的添加，具有多糖收率高、过程简单快速、减少时间成本、人力成本和物料成本等优点。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种简便有效的细菌疫苗纯化方法，其特征在于：

S1、生产荚膜多糖的细菌发酵液，培养至吸光度保持恒定并开始下降时，终止培养；

S2、用组氨酸缓冲液稀释发酵液OD₆₀₀至6.0以下，加裂解剂至终浓度为 0.08～0.15％(w/v)，控温14～18℃，持续搅拌24～48小时；

S3、将S2步骤处理后的发酵液调pH至2.0～3.0，然后静置沉淀；