[发明专利]高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法及其应用

说明书

本申请公开了一种高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法及其应用。本申请方法，包括采用定制微孔芯片和ICELL8平台识别单细胞，并在微孔芯片微孔中，对单细胞进行细胞裂解、mRNA逆转录、cDNA预扩增和Tn5转座酶建库，产物可直接用于测序；在mRNA逆转录或Tn5转座酶建库过程中，引入5’端和3’端双端Barcode序列，以获得单细胞全长转录组。本申请方法，单细胞识别通量高，且产物可直接测序。采用本申请方法进行单细胞测序，只需两天时间，即可一次性高效获取数千个单细胞层面全长转录组库，大大降低了人工和时间成本，并且微量反应体系也大大降低了试剂成本，为大规模单细胞全长转录本测序奠定了基础。

技术领域

本申请涉及单细胞测序领域，特别是涉及一种高通量的单细胞全长转录组库的制备方法及其应用。

背景技术

近年来单细胞测序技术飞速发展，在发育研究及癌症研究等领域取得了重要成果，但高昂的实验费用是矗立在研究人员面前一道难以逾越的障碍，因此高通量、低成本的单细胞制备技术和测序平台仍然有广阔的前景。

目前商品化的单细胞处理平台包括Fluidigm C1，10×genomics的GemCode，以及Wafergen的ICELL8。其中Fluidigm C1通过将细胞染色并拍照的方式可以识别确定单个细胞，该技术是在一个集成的芯片区域，有48×2共96个微小的微流控小室。每一个微流控小室均是独立分割开在不同位置，通过控制微流控小室的开关，来添加细胞液和后续的反应体系并完成反应。Fluidigm C1具有时间快速、重复性好、数据稳定性好等优点，并且，可以捕获制备全长转录本。但是，Fluidigm C1通量受限于其微流体芯片的设计，一次只能产生96个转录本，而且只能产生cDNA扩增产物，cDNA扩增完后需要手工将每个微流控小室的产物转移到对应的96孔板中进行后续的建库，不能直接形成文库进行测序，后续文库构建通量低、耗时长。

10×genomics公司的GemCode能够与现有的短读取测序仪互补，产生10-100kb的长片段信息，实现结构变异和单体型等分析。GemCode仪器基于液滴微流控的技术，其技术核心是对单细胞进行精确分区，形成包含分子条形码的皮升(缩写pL)大小的液滴，进行后续的转录本的构建。但是该技术只能检测含有条形码一端的信息，不能检测全长转录本，而且存在0.8％～5％的多细胞比例。GemCode基于液滴微流控的方法，有液滴双包裹单细胞之间交叉污染、包裹效率低、成本高，只能产生3’端转录本信息等缺点。

Wafergen公司的ICELL8也是通过将细胞染色并拍照的方式可以识别确定单个细胞。ICELL8平台能够一次分选并识别1000个以上单细胞孔位，进行后续的转录本分析。该技术预先在微孔芯片中添加3’端Barcode序列，然后单细胞在mRNA的分离和第一链cDNA的扩增过程中结合上这段Barcode序列；cDNA收集之后，只有含有这段Barcode的3’端序列才能被区分开来。ICELL8采用的是纳升(缩写nL)级微孔芯片技术，但受限于微孔芯片的容量问题，只能产生3’端转录本信息；后续文库构建通量低、耗时长。

因此目前尚没有理想的技术可以在单细胞层面实现高通量的全长转录本的扩增的同时，实现一体化的测序文库构建，以缩短测序时间和费用。

发明内容

本申请的目的是提供一种改进的高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法及其应用。

为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：