[发明专利]基于三通连接-核酸分子线路换能器的分子检测方法

说明书

本发明公开了一种基于三通连接‑核酸分子线路换能器的分子检测方法，属于基因检测技术领域。本发明是针对单元或多元核酸检测时需要完全按照不同的目标待测核酸去重新设计引物的序列而提出的方法，包括以下步骤：步骤(1)：由目标核苷酸和传导探针制备分子引发剂；步骤(2)：将核酸分子线路各组分分别进行退火处理；步骤(3)：将分子引发剂、核酸分子线路各组分混合加热；步骤(4)：检测荧光信号，获得荧光检测曲线。本发明的方法，灵敏度高、特异性好，不同的目标待测核酸可以共用同一套核酸分子线路，实现只用一套核酸分子线路，一种信号探针去检测不同目标基因的目的，最大程度的降低了设计风险和成本，可用于单元或者多元核酸的检测。

技术领域

本发明涉及核酸分子检测技术领域，尤其涉及一种基于三通连接-核酸分子线路换能器的分子检测方法。

背景技术

基因是指携带有遗传信息的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)碱基排列(序列)。从现代医学的角度出发，除外伤外，几乎所有的疾病都和基因有关系。因此，精准检测到基因序列信息，就意味着获取了任何生物类病原的最直接标签。人们对这一理念的高度认可刺激了上个世纪后期以来基因测序和基因诊断学的蓬勃发展和广泛应用。其中，基因诊断学是除了基因测序以外的所有基因检测方法的统称。

目前，医疗、检验检疫等单位使用最为广泛的基因诊断法是发明于1983年的热循环聚合酶链扩增反应(PCR)，但是PCR反应不能实现实时检测，为了更进一步的实现实验的可能性和最终实现现场即时检测(POCT)，一系列的超灵敏等温放大技术得到发展，如用核酸序列为基础的扩增核酸依赖性扩增检测技术(NASBA)、滚环扩增(RCA)、解链酶扩增(HAD)、重组酶聚合酶扩增(RPA)和环介导等温扩增技术(LAMP)等。其中，LAMP是一个极有效的等温核酸放大技术，它能在一个小时内将很少的目标基因片段放大到10⁹倍，但是与此同时也会出现大量的非目标DNA，因此检测它的目标产物变的十分困难。

面对以上症结，国内外先驱已基于前人建立的信号传导原理陆续提出“探针吸附法”、“探针累积法”和“序列特异识别法”三种解决办法。在前两种方法中，非目标产物通过自组装并不会被表现出来，例如在聚合过程中产生的焦磷酸离子，形成白色沉淀的焦磷酸盐，所以这些扩增产物可以被肉眼识别。另外，可以通过将染料钙黄绿素和羟基萘酚蓝扦插到核酸碱基对中来进行实时荧光检测。这种检测方法的弊端是由于随机的扦插产生假阳性信号。前两中方法的信号分别来源于扩增产物对小分子电化学探针(如亚甲基蓝和二茂铁等)产生的非特异性吸附和链增长累积，虽然足够灵敏，但这两种方法都只是识别核酸碱基对数目，而不是碱基排序，因此无法有效区分正确的扩增产物和非特异性的错误扩增副产物，频发假阳性误诊。

相比之下，“序列特异识别法”由于依赖扩增产物与其互补序列进行杂交，因此特异性高的多，基本可以排除假阳性误诊。为了提高检测的选择性，特异性的检测方法后续也有类似的方法，如PCR中加入Taqman探针，近期也延伸到等温扩增技术中，尤其是环介导等温扩增技术。为了获得最高的杂交效率，序列特异性识别法的最佳检测对象是如环介导等温扩增技术等能生成单链环产物的反应。在所有的等温扩增中，环介导等温扩增技术是尤其的特异，因为它可以只利用一个聚合酶去扩增RNA或DNA模板达到10⁹倍。通过交替延展和链置换反应，最终扩增出包含四种单链环序列的长茎环多联体。这些非杂交的环，通常15到35个碱基，可以作为下游序列特异性的信号探针输入口。而“序列特异识别法”的缺点是信号噪音偏高、单点突变分辨率差，当正确扩增产物被错误副产物稀释时，更会因检不出而频发假阴性误诊，且针对不同的待测物需重新设计探针序列，繁琐且增加检测成本和时间。