[发明专利]活化转录HSP70的NS31基因的编码序列的应用

说明书

技术领域

本发明涉及属于生物技术领域，特别涉及活化转录HSP70的NS31基因的编码序列的应用。

背景技术

热休克效应是生物体在受热条件下保守的应激反应之一，在哺乳动物细胞中，热休克诱导细胞膜，细胞骨架和细胞器结构与功能的改变，影响细胞死亡，细胞周期，基因的转录翻译以及DNA的复制和修复等生命过程。热休克蛋白(Heat shock proteins，HSPs)在受热，生理变化或小分子化合物刺激下被诱导转录表达；热休克蛋白HSP70家族在真核生物中高度保守，能够促进蛋白折叠，降解和跨膜转运，以及蛋白与蛋白的相互作用等。HSP70的抑制剂和活化剂可以应用于热休克蛋白的基础研究领域，也可应用于新药开发的领域；许多小分子化合物能够抑制或活化HSP70的转录表达，如Apoptozole抑制热激蛋白HSP70和Hsc70转录表达；TRC051384能通过HSF1的激活诱导HSP70表达等。中国发明专利申请公布号：CN 102816792 A(一种调控热休克蛋白70表达、数量及活性的方法及其应用)，以RNA干扰技术，下调肿瘤细胞或组织中HSP70的表达，联合应用抗肿瘤药物TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡；中国发明专利申请公布号：CN 105439972 A(热休克蛋白抑制剂及其制备方法和应用)，提供一种新的热休克蛋白抑制剂，该类化合物能够抑制HSP90的活性，进而可以用于制备抗肿瘤的药物中；目前，国内没有HSP70的活化剂的研究报道和专利公开。

草鱼呼肠孤病毒粒子直径约70nm，正二十面体；具有双层衣壳，无脂质囊膜包被；主要通过受体吸附，胞吞作用(Endocytosis)侵染宿主细胞，在细胞质中复制装配，其基因组是11个分节段的dsRNA，基因组编码12个蛋白，其中NS31蛋白由Seg-7基因编码，非结构蛋白NS31是个潜在的转录因子，在细胞质和核中均有分布；本发明中说明NS31蛋白能够促进HSP70转录，具有活化特性。

现有技术应用中，HSP70的活化剂大多是小分子化合物类，这些小分子化合物本身存在如下问题：1)一些化合物对细胞和动物具有毒性；2)特异性较差，在活化HSP70的同时可能还影响其它热休克蛋白的转录表达，如HSC70，HSP90和其它小分子类热休克蛋白；3)制备工艺要复杂，获得高纯度的化合物(99.9％)成本较高。细胞在热刺激条件下，启动一系列热应激反应，诱导大部分热休克蛋白的活化转录包括HSP70，这一方法是最典型的热休克效应的诱导方法，但其诱导HSP70活化的同时还诱导其它一系列蛋白的转录表达。

发明内容

本发明公开活化转录HSP70的NS31基因的编码序列的应用，本发明的目的是获得一种能够诱导HSP70转录表达的蛋白序列即NS31基因的编码序列的应用，使用NS31重组质粒pEGFP-N1-NS31在真核细胞中能够诱导热休克蛋白HSP70转录活化。

为解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

活化转录HSP70的NS31基因的编码序列的应用，(1)将载体pEGFP-N1和NS31基因的编码序列分别利用Xho I/Pst I限制内切酶进行双酶切，37℃，20-30min，进行DNA纯化，T4连接酶16℃连接18-20h，与绿色荧光蛋白GFP编码基因形成一个完整的阅读框获得pEGFP-N1-NS31质粒；

(2)用步骤(1)中获得pEGFP-N1-NS31质粒转染真核细胞中，够诱导热休克蛋白HSP70转录活化，同时不会对HSC70和HSP90转录水平产生影响。

所述步骤(1)中NS31基因的编码序列通过设计克隆引物进行RT-PCR从GCRV-JX01病毒感染的草鱼肾脏细胞中扩增出。

所述克隆引物为：F:CCGCTCGAGATGAACGCCGACCGCACC；R:AAAACTGCAGCCAGCAACCATTGTCCATTAAC。下划线分别为酶切位点Xho I/Pst I及其保护碱基。

所述PCR反应体系为：50μl体系中：ExTaq Buffer 5μl，dNTP 4μl，10mmol/L克隆引物正引物F 1-2μl，10mmol/L克隆引物正引物R 1-2μl,ExTaq酶0.1-0.3μl，ddH2O剩余；

所述PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1-1.5min，30-35个循环；72℃补充延伸5min。

所述步骤(1)中的NS31基因的编码序列在Genbank的登录号为MG189638。