[发明专利]一种烟草多酚氧化酶基因NtPPO1及其定点突变方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种烟草多酚氧化酶基因NtPPO1及其定点突变方法与应用。

背景技术

多酚氧化酶（PPO，polyphenol oxidase）是在自然界中广泛存在的一类铜结合酶，一般具有两种活性:加氧酶及脱氢酶活性。多酚氧化酶广泛存在于动植物及真菌中，多酚氧化酶可被分为单酚氧化酶（酪氨酸酶，tyrosinase）、双酚氧化酶（儿茶单酚氧化酶，catechol oxides）和漆酶（laccase）。

植物中的PPO基因多以基因家族形式存在。在茄科经济作物中，茄子中找到个6个PPO基因；番茄中发现7个PPO基因；马铃薯中有2个PPO基因。红三叶草中找到至少6个PPO基因。Cai等发现高粱中存在8个不同的PPO基因。但葡萄藤中只发现一个PPO基因。

PPO活性具有植物组织差异性。PPO广泛存在于植物的多种器官中，如叶片、根、块茎及花中，幼嫩部位含量较高而在成熟部位含量较低(谢春艳和宾金华, 1999)。马铃薯中PPO在块茎、根及花中含量较高，而在叶片中含量较低；PPO的活性随着块茎的发育不断升高。PPO活性在烟草苗期活性较高；进入旺长期后，叶片中PPO活性继续升高；进入成熟期后，PPO活性逐渐下降；并且PPO活性呈现上部叶>中部叶>下部叶的规律。

PPO活性受到外界环境的调控。嘎拉苹果多酚氧化酶反应的最适pH值为6.0，最适反应温度是45℃。Palma-Orozco从马曼果中分离出两种同工酶（PPO1和PPO2），最适pH为7.0，最适温度是35℃。Rahman从花椰菜中分离出一种PPO，最适pH为8.0，最适温度为55℃。Han-Ju（2012）从油菜花中分离出的PPO最适pH为5.5，在60℃到70℃之间活性较为稳定。

多酚氧化酶在烟叶酶促褐变反应中具有重要的作用。烟草中多酚氧化酶能够将酚加氧催化生成醌；醌能够与其它物质如蛋白质、氨基酸及其它化合物结合生成色素类物质。该过程在烟草中被称为多酚氧化酶介导的酶促棕化反应，该过程中绿原酸、芸香苷等烟草重要的致香前体物质氧化为淡红色至黑褐色物质；因此会显著降低烟叶的外观品质，减少烟叶香气成份，最终会导致烟叶外观与内在品质下降，从而给烟农与烟企带来经济损失。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种烟草多酚氧化酶基因NtPPO1；第二目的在于提供所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1的定点突变方法；第三目的在于提供所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：

A、烟草叶片cDNA合成：提取烟草根组织RNA，反转录得到第一链cDNA；

B、NtPPO1基因的PCR扩增：以烟草叶片cDNA作为模板，根据NtPPO1基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序；

C、NtPPO1基因的CRISPR/Cas9载体的构建：根据基因序列设计靶位点sgRNA序列，合成sgRNA引物序列，将sgRNA序列通过酶切和连接进pORE-CRISPR/Cas9植物表达载体；

D、NtPPO1基因突变测序检测：根据NtPPO1基因序列设计特异性检测引物，通过高保真DNA聚合酶扩增NtPPO1的基因序列片段，通过Sanger测序方法测序PCR产物，与NtPPO1基因序列进行比对，如果在靶位点sgRNA序列后出现双峰即为突变成功。

本发明的第三目的是这样实现的，所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1在获得抗烟草褐变转基因植株中的应用。

CRISPR/Cas9技术作为一种最新涌现的基因组编辑工具，能够完成RNA导向的DNA识别及编辑。

CRISPR/Cas9技术使用一段序列特异性向导RNA分子（sequence-specific guide RNA，sgRNA）引导高度保守的CRISPR相关基因（Crispr-associated gene,Cas gene, Cas9）编码的核酸内切酶,到靶位点处对DNA序列进行特异性的切割，从而完成基因组的编辑。CRISPR/Cas系统的开发为构建更高效的基因定点修饰技术提供了全新的平台。

CRISPR/Cas系统的载体构建较以往的基因编辑系统更为简便快捷，该系统已广泛应用于酵母、动植物细胞等细胞水平基因组改造，以及水稻、拟南芥、烟草、线虫、果蝇、斑马鱼及小鼠等各类模式研究系统。