[发明专利]一种烟草多酚氧化酶基因NtPPO1及其定点突变方法与应用

权利要求书

1.一种烟草多酚氧化酶基因NtPPO1，其特征在于所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1，其特征在于所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种权利要求1或2所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1的定点突变方法，其特征在于包括以下步骤：

A、烟草叶片cDNA合成：提取烟草根组织RNA，反转录得到第一链cDNA；

B、NtPPO1基因的PCR扩增：以烟草叶片cDNA作为模板，根据NtPPO1基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序；

C、NtPPO1基因的CRISPR/Cas9载体的构建：根据基因序列设计靶位点sgRNA序列，合成sgRNA引物序列，将sgRNA序列通过酶切和连接进pORE-CRISPR/Cas9植物表达载体；

D、NtPPO1基因突变测序检测：根据NtPPO1基因序列设计特异性检测引物，通过高保真DNA聚合酶扩增NtPPO1的基因序列片段，通过Sanger测序方法测序PCR产物，与NtPPO1基因序列进行比对，如果在靶位点sgRNA序列后出现双峰即为突变成功。

4.根据权利要求3所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1的定点突变方法，其特征在于B步骤中所述的引物为：

正向引物：5’-ATGGCTTCTTCATTTGTTCTTCAAGC-3’

反向引物：5’-TTAACAAGGGACCAACTGGATCTCAAC-3’。

5.根据权利要求3所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1的定点突变方法，其特征在于B步骤中PCR反应体系为： PCR扩增体系为50μl，其中包含10.0μl 的5 X buffer （10 mM Tris-HCl，50 mM KCl，1.5 mM MgCl₂，pH 8.3 @ 25℃），4μl 的 2.5 mM dNTPs（Takara Biotechnology Co. Ltd., Dalian, China），2μl 浓度10μM 的上下游引物，0.5μl的2000U/ml高保真DNA聚合酶（NEB），20-50ng模板DNA，最后用ddH2O补齐50μl；反应条件为：95℃预变性5分钟，30个循环（95℃变性30秒，复性30s，72℃延伸30s），72℃延伸5分钟，4℃保存。

6.根据权利要求3所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1的定点突变方法，其特征在于C步骤中sgRNA序列为： 5’-CATTTGTTCTTCAAGCTCCA-3’。

7.根据权利要求3所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1的定点突变方法，其特征在于D步骤中所述的特异性引物为：

正向引物：5’-TTCACGCACTAATTCGTCTCATTGGA-3’

反向引物：5’-TCTGTCGGCAACGCCTTCA-3’。

8.一种权利要求1或2所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1的应用，其特征在于所述的烟草多酚氧化酶基因NtPPO1在获得抗烟草褐变转基因植株中的应用。