[发明专利]依托泊苷/替尼泊苷疗效相关基因多态性检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明提供了依托泊苷/替尼泊苷疗效相关基因（CYP3A4和MDR1）基因多态性检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包括PCR缓冲液，特异性ARMS检测引物，内控引物。本发明还提供了依托泊苷/替尼泊苷疗效相关基因（CYP3A4和MDR1）的基因多态性检测方法。该方法可以快速准确地检测依托泊苷/替尼泊苷疗效相关基因（CYP3A4和MDR1）的基因多态性，具有灵敏度高，特异性强，方法简单，结果准确等特点。

技术领域：

本发明涉及生物技术及医学领域，特别是涉及依托泊苷/替尼泊苷疗效相关基因(CYP3A4和MDR1)基因多态性检测试剂盒及检测方法。

背景技术：

依托泊苷/替尼泊苷是一类作用于细胞周期的特异性抗肿瘤药物，主要作用于细胞周期S期和G2期，使细胞不能进行正常分裂，其通过作用位点拓扑异构酶II形成一种药物-酶-DNA三者之间的稳定的可裂性复合物，干扰DNA拓扑异构酶II，导致受损的DNA不能修复。临床上依托泊苷/替尼泊苷用于治疗恶性肿瘤、急性病白血病、膀胱癌等。

CYP3A4是人体内重要的药物代谢酶，研究发现，依托泊苷和替尼泊苷在人体内主要通过CYP3A4代谢，而人体内CYP3A4基因存在多个多态性位点，大部分位点均能降低CYP3A4活性，从而影响药物在体内的代谢过程。CYP3A4基因I118V位点突变使CYP3A4酶活性降低，从而导致依托泊苷和替尼泊苷药物在体内的清除率降低。

MDR1基因编码的P-gp是药物在人体内代谢过程中重要的转运体，同时也参与了很多药物在体内的相互作用。P-gp能过转运大量的化学结构不同的化合物，包括抗肿瘤药物依托泊苷和替尼泊苷。MDR1基因多态性直接影响P-gp的分布和功能，并影响药物在P-gp底物药物在体内的代谢过程。研究发现MDR1基因C3535T位点多态性与P-gp表达功能密切相关，3435C＞T位点突变后导致P-gp表达水平低，使药物在体内维持相对较高的血药浓度，所以药物生物利用度相对较高，疗效较好。

关于基因突变检测方法有很多，各国学者对此都进行了大量研究。己经报道的方法包括直接测序法、DHPLC、PCR-SSCP/RFLP、Scorpions ARMS、TaqMan PCR、ME-PCR等。这些方法各有优缺点，其中在临床和科研中较为常用的方法为直接测序法以及ARMS(Amplification refractory mutation system,扩增阻滞突变系统)法。

直接测序法检测能力有限，其检测灵敏度约20％左右，而且步骤复杂，整个检测过程涉及PCR-电泳-测序-测序结果的解读等一系列的步骤，费时费力，但是该方法的优点是能够发现一些新的未知突变。

ARMS方法是将分子信标(探针)与特异性的ARMS引物相结合创造出来的，ARMS引物3’端设计在突变位点，最后一个碱基与突变碱基配对，釆用无3’→5’外切酶活性的TaqDNA聚合酶，特异性的识别引物的3’末端，只有引物3’末端完全配对时，才能正常扩增，当引物3’末端发生错配时，不能有效的扩增。当引物与突变模板结合并延伸出相应的产物后，探针两端的荧光基团和淬灭基团分离而产生荧光。目前，市场上相关试剂盒包括QIAGEN公司和厦门艾德公司，价格昂贵。

因此，本研究釆用ARMS技术与SYBR染料相结合的方法，研发出一种拥有完全自主知识产权并且能够快速、敏感而且简便的检测依托泊苷/替尼泊苷疗效相关基因(CYP3A4和MDR1)基因多态性的试剂盒。通过自己研发设计ARMS引物以及将Scorpions探针换为SYBR染料以使检测成本大大降低，这样更适合中国患者CYP3A4和MDR1基因多态性的检测。综上所述，该检测试剂盒及检测方法是一种灵敏度高，特异性强，方法简单，结果准确的依托泊苷/替尼泊苷疗效相关基因(CYP3A4和MDR1)基因多态性检测方法。

发明内容：