[发明专利]依托泊苷/替尼泊苷疗效相关基因多态性检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种依托泊苷/替尼泊苷疗效相关基因(CYP3A4和MDR1)基因多态性检测试剂盒，该试剂盒用于检测基因多态性的引物包括：

CYP3A4(352)：5′-GGATTTATGAGAAGTGGCA-3′SEQ ID NO:1

5′-GGATTTATGAGAAGTGTCG-3′SEQ ID NO:2

5′-CCTGTCCCCACCAGATTC-3′SEQ ID NO:3

MDR1(3435)：5′-CCTTTGCTGCCCTAACG-3′SEQ ID NO:4

5′-TCCTTTGCTGCCCTAACA-3′SEQ ID NO:5

5′-GAATGTTCAGTGGCTCCGA-3′SEQ ID NO:6

内控：5’-AGCAAGCAGGAGTATGACG-3'SEQ ID NO:7

5'-GAAAGGGTGTAACGCAACT-3'SEQ ID NO:8 。

2.如权利1要求所述的依托泊苷/替尼泊苷疗效相关基因(CYP3A4和MDR1)基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液包括3’→5’外切酶活性高保真Taq酶，1.0-5.0mM的MgCl₂，1.0-5.0mM的dNTPs，即dATP、dUTP、dGTP、dCTP各1.0-5.0mM以及SYBR Green I。

3.一种依托泊苷/替尼泊苷疗效相关基因(CYP3A4和MDR1)基因多态性检测方法，包括以下步骤：

(1)提供如权利要求1中所述的引物；

(2)待测样品的处理和模板的提取；

(3)配制荧光定量PCR反应体系及条件；

(4)利用ARMS引物区分野生型和突变型基因序列，通过SYBR GREEN染料和扩增产物的杂交，检测反应体系的SYBR荧光强度来判定检测结果。SYBR为检测信号，以SYBR信号达到设定的阈值所需的的循环次数Ct值作为判断标准，Ct值小于32为阳性，Ct值大于35为阴性，Ct值介于32到35之间为弱阳性。

4.如权利3所述的一种检测依托泊苷/替尼泊苷疗效相关基因(CYP3A4和MDR1)基因多态性的方法，其特征在于：步骤(2)所述的待测样品包括手术切除的新鲜病理组织，甲醛固定石蜡包埋的病理组织，石蜡切片，全血，血浆，血清，胸腔积液。

5.如权利1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照液和阴性对照液；

所述阳性对照液为含有试剂盒内可检测的4个位点对应的质粒混合液，所述4种质粒分别含有4种不同的带有待检测突变位点的CYP3A4和MDR1等位基因；所述质粒浓度为1000copies/μl；

所述阴性对照液为Tris-HCL缓冲液，所述的Tris-HCL缓冲液的浓度为7-13mM，pH为7.5-8.5。

6.如权利3要求所述的一种依托泊苷/替尼泊苷疗效相关基因(CYP3A4和MDR1)基因多态性检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中的PCR体系中各组分终浓度及含量如下：

7.如权利3要求所述的一种依托泊苷/替尼泊苷疗效相关基因(CYP3A4和MDR1)基因多态性检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中的PCR反应条件为：

95℃ 15分钟，40个循环：95℃ 10秒，60℃ 30秒。