[发明专利]一种鸡成骨细胞体外分离培养方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种鸡成骨细胞体外分离培养方法。

背景技术

成骨细胞是间质来源细胞，具有强大的分泌功能，骨基质成分几乎都由成骨细胞分泌。作为骨形成和发育过程中的一种重要功能细胞，成骨细胞是骨组织修复和骨质疏松等领域的研究热点。自1964年首次成功分离新生大鼠成骨细胞至今，采用人和动物的正常骨或骨肉瘤组织培养了许多成骨样细胞培养体系。虽然来源于骨肉瘤的细胞系常用于研究，但是它具有肿瘤细胞的特点，与正常成骨细胞在基本结构、代谢和功能特性等方面存在一定的差异，无法真实反应体内正常的生物学特点。

与骨肉瘤细胞系相比，原代培养的成骨细胞更接近正常生理水平。成骨细胞的原代培养方法主要有酶消化法(程浩等，新生大鼠成骨细胞原代培养与鉴定，中国组织工程研究，2013，17(41)，7199-7204)和组织块贴壁法(CN105505862A)，而且主要取材于大鼠。不同于大鼠等胎生动物，鸡是卵生动物，它的成骨细胞可能具有特异的生物学特点。从孵化的鸡胚取材，分离原代的成骨细胞更加简单方便。此外，鸡胚成骨细胞是探究鸡的骨骼发育、代谢和骨质疏松等疾病的重要研究对象。

目前，鸡的原代成骨细胞分离通常采用酶消化法，主要有两种，一种是用胰蛋白酶和胶原酶混合酶液反复消化5次，取第2-5次的消化液收集细胞(Yao et al.,Effects of ipriflavone on caged layer bone metabolism in vitro and in vivo,Poultry Science,2007,86,503-507.)，该方法通常细胞得率非常低，步骤繁琐。另一种方法是先用胰蛋白酶消化颅骨，再用胶原酶消化颅骨组织块(江莎等，鸡骨钙素蛋白的原核表达及其生物学活性，南京农业大学学报，2013，36(6)，60-66；Chen et al.,17β-estradiol combined with testosterone promotes chicken osteoblast proliferation and differentiation by accelerating the cell cycle and inhibiting apoptosis in vitro,Veterinary Research Communications,2010,34,143-152.)，这种方法细胞得率高，但是忽略了细胞纯化的步骤，细胞的纯度非常低。成骨细胞属于成纤维细胞样的细胞，容易受到成纤维细胞的污染，需要用适当的方法去除成纤维细胞，并从理化特性上鉴定区分成骨细胞和成纤维细胞。

因此，有必要开发一种操作过程简便、细胞得率和纯度高、生长迅速的鸡成骨细胞分离培养方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷，开发一种操作过程简便、细胞得率和纯度高、生长迅速、状态良好的鸡成骨细胞体外分离培养方法。

为了实现上述目的，本发明提供一种鸡成骨细胞体外分离培养方法，该方法包括以下步骤：

(1)选用15-16胚龄的种蛋，无菌条件下取鸡胚的颅骨，剥离结缔组织，刮除骨膜直至颅骨发白，用含有抗生素的缓冲溶液洗涤；胚龄的选择很关键，过早颅骨还没有形成，过晚成骨细胞的分化能力较差；

(2)将洗涤后的颅骨置于胰蛋白酶溶液中，于37℃培养箱中孵育，弃去消化液，用缓冲溶液洗涤；

(3)将步骤(2)处理后的颅骨剪成0.8-1.2mm³的组织块，并转移至离心管中，加入II型胶原酶溶液，于37℃培养箱中孵育；

(4)用含有胎牛血清的培养基终止消化，使未消化的大块骨组织沉降，取消化液；

(5)将所述消化液离心弃去上清液，用含有胎牛血清、青霉素和链霉素的培养基重悬沉淀物，混匀后移入T25细胞培养瓶中；

(6)采用差速贴壁的方法去除成纤维细胞，在37℃、5％CO₂培养箱中培养25-35min后，弃去贴壁的成纤维细胞，将未贴壁的细胞悬液转移至另一T25细胞培养瓶中，置于培养箱中培养；25-35min的培养时间很关键，时间过短无法去除成纤维细胞，时间过长成骨细胞也会被除去；

(7)定期更换培养液，待原代成骨细胞长满，用胰蛋白酶消化，差速贴壁纯化后传代。

根据本发明一种优选实施方式，步骤(1)中，所述抗生素为青霉素和链霉素；所述青霉素的浓度为90-110U/mL，所述链霉素的浓度为90-110μg/mL，体积为1.5-3mL；所述缓冲溶液为PBS缓冲液。