[发明专利]一种鸡成骨细胞体外分离培养方法

权利要求书

1.一种鸡成骨细胞体外分离培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)选用15-16胚龄的种蛋，无菌条件下取鸡胚的颅骨，剥离结缔组织，刮除骨膜直至颅骨发白，用含有抗生素的缓冲溶液洗涤；

(2)将洗涤后的颅骨置于胰蛋白酶溶液中，于37℃培养箱中孵育，弃去消化液，用缓冲溶液洗涤；

(3)将步骤(2)处理后的颅骨剪成0.8-1.2mm³的组织块，并转移至离心管中，加入II型胶原酶溶液，于37℃培养箱中孵育；

(4)用含有胎牛血清的培养基终止消化，使未消化的大块骨组织沉降，取消化液；

(5)将所述消化液离心弃去上清液，用含有胎牛血清、青霉素和链霉素的培养基重悬沉淀物，混匀后移入T25细胞培养瓶中；

(6)采用差速贴壁的方法去除成纤维细胞，在37℃、5％CO₂培养箱中培养25-35min后，弃去贴壁的成纤维细胞，将未贴壁的细胞悬液转移至另一T25细胞培养瓶中，置于培养箱中培养；

(7)定期更换培养液，待原代成骨细胞长满，用胰蛋白酶消化，差速贴壁纯化后传代。

2.根据权利要求1所述的鸡成骨细胞体外分离培养方法，其中，步骤(1)中，所述抗生素为青霉素和链霉素；所述青霉素的浓度为90-110U/mL，所述链霉素的浓度为90-110μg/mL；所述缓冲溶液为PBS缓冲液。

3.根据权利要求1所述的鸡成骨细胞体外分离培养方法，其中，步骤(2)中，所述胰蛋白酶溶液的浓度为0.25-0.5％，体积为1.5-3mL；所述孵育的时间为10-20min；所述缓冲溶液为PBS缓冲液。

4.根据权利要求1所述的鸡成骨细胞体外分离培养方法，其中，步骤(3)中，所述II型胶原酶溶液的浓度为0.8-1.2g/L；所述孵育的时间为40-60min。

5.根据权利要求1所述的鸡成骨细胞体外分离培养方法，其中，步骤(4)中，所述胎牛血清的浓度为10-15％；所述培养基为DMEM/F12培养基。

6.根据权利要求1所述的鸡成骨细胞体外分离培养方法，其中，步骤(5)中，所述胎牛血清的浓度为10-15％；所述青霉素的浓度为80-120U/mL；所述链霉素的浓度为80-120μg/mL；所述培养基为DMEM/F12培养基。

7.根据权利要求1所述的鸡成骨细胞体外分离培养方法，其中，步骤(7)中，所述胰蛋白酶的浓度为0.25-0.5％。