[发明专利]一种鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物及设计和扩增方法

说明书

本发明涉及一种可用于快速鉴别鲽形目鳎科鱼类的鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物及设计和扩增方法，所提供的鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物可以高效和特异地扩增弯鲽形目鳎科鱼类蛸的ITS2，并能够一次性对多个物种同时进行扩增，具有高效快速和便捷的优点，且由于ITS2序列在鳎科鱼类不同物种中长度差异明显，可以通过凝胶电泳技术直接肉眼观察，进而高效快捷对形态相似或者形态损伤的物种进行鉴定。

技术领域

本发明涉及一种分子生物技术领域，尤其涉及一种可用于快速鉴别鲽形目鳎科鱼类的鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物及设计和扩增方法。

背景技术

鳎科(Soleidae)作为鲽形目鱼类最丰富的类群，约有35属175种，很多种类都具有非常重要的经济价值，但是迄今关于鳎科鱼类核糖体序列的报道极其罕见，其中关于核糖体内转录间隔区2的研究更是空白。

核糖体内转录间隔区2（internal transcribed spacer1，简称ITS2）是一段位于核糖体RNA编码基因5.8S rDNA和28S rDNA中间的一段非编码区。5.8S rDNA和28S rDNA进化速率较慢，序列非常保守，而ITS2进化速率相对较快，在种内基本趋于相似，而在种间则表现出显著的差异，因此可以作为区分不同物种以及进行系统进化分析的分子标记。

中国专利局于2017年9月29日公开了一种蜘蛛线粒体基因组全序列扩增引物及扩增方法的发明授权，授权公开号：CN104531688B，该发明采用提取蜘蛛基因组的总DNA，通过线粒体基因组DNA的长PCR(L-PCR)扩增和测序对蜘蛛进行鉴定，但其仅能对蜘蛛进行扩增；同样是采用DNA技术对生物进行鉴定，但是其不能对明确的生物物种进行鉴定，且必须通过测序才能准确判定，并需要设计多对引物对基因组全序列进行扩增，耗时较长，过程繁琐。

发明内容

为解决上述迄今关于鳎科鱼类核糖体序列的报道极其罕见，其中关于核糖体内转录间隔区2的研究更是空白的问题，本发明提供了一种通过设计鳎科鱼类ITS2的通用引物，能够一次性批量扩增多种头足类ITS2，不需要针对某个单独物种设计特异性引物，既节省了时间成本，又大大提高了工作效率，具有高效快捷特点的鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物及设计和扩增方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物，所述鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物包括：正向引物SEQ ID NO.1:5' - DACAACTCTTAGCGGTGGATCA -3'，反向引物SEQ ID NO.2:5' - GCTCTTCCCTCTTCACTCG - 3'。

作为优选，所述鲽形目鳎科鱼类包括但不限于：蛾眉条鳎、缨鳞条鳎、带纹条鳎、日本条鳎、东方箬鳎、眼斑豹鳎、圆鳞鳎、褐斑栉鳞鳎、角鳎、卵鳎、塞内加尔鳎和卡氏大鼻鳎。

一种鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物的设计方法，从Genbank数据库中下载目前所有已经公布的鳎科鱼类5.8S rDNA和28S rDNA序列，对这些序列进行多重比对，分别在3’端和5’端找出比较保守的序列用于设计扩增ITS2的通用引物。

一种鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物的扩增方法，所述鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物的扩增方法包括以下步骤：

（1）DNA抽提试剂盒法提取鲽形目鳎科鱼类的总DNA；

（2）采用权利要求1中所述的鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物；

（3）以待测鲽形目鳎科鱼类的总DNA作为模版，进行PCR扩增；

（4）扩增引物用1.0%琼脂糖凝胶电泳，试剂盒法割胶回收扩增片段，测序及序列拼接。