[发明专利]一种基于CRISPR的DNA检测和分型方法及其应用

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR的DNA检测和分型方法及其应用；该方法包括如下步骤：(1)用一对通用引物PCR扩增靶DNA；(2)用Cas9/sgRNA切割扩增后的靶DNA；(3)用DNA连接酶连接被切割的靶DNA；(4)用PCR扩增连接后的靶DNA。本发明利用了CRISPR技术对DNA的特异性识别切割特性，可以简单、快速、灵敏地对目标DNA进行特异性检测和分型，是一种具有高特异性和灵敏度的DNA检测新方法，成功避免了目前核酸检测和分型领域中核酸杂交和特异性PCR引物设计等关键瓶颈问题。通过运用本发明的方法成功检测人宫颈癌细胞中HPV16和HPV18的L1和E6/E7基因。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体一种基于CRISPR的DNA检测和分型方法及其应用。

背景技术

对于基础研究、各种检测及诊断应用，DNA检测和基因分型一直很重要。因此，DNA检测和基因分型技术一直受到广泛关注，从而促进了该类技术发展。简而言之，主要有三类DNA检测和基因分型技术被广泛应用。第一种是基于聚合酶链反应(PCR)的各种技术。PCR是最常用的DNA检测和基因分型技术。基于PCR的DNA检测和基因分型主要依赖于特异性引物的设计和多重PCR扩增。PCR检测可以通过传统PCR(tPCR)，定量PCR(qPCR)和最近开发的数字PCR来实现。因为具有明显的优点，如实时检测和高灵敏度，Q-PCR在几乎所有的研究、检测和诊断实验室中得到高度普及。现在已经开发出更准确的数字PCR，作为临床检测工具，具有很大的潜力和优势。然而，PCR技术在用于区分高度相关的基因型时，要受到多重扩增和高度特异性引物的限制。除PCR技术外，DNA微阵列等多种DNA杂交技术也被广泛用于检测和分型DNA。然而，由于其昂贵的设备，复杂的检测流程和不可避免的非特异性杂交，DNA微阵列技术不能像PCR一样成为常规DNA检测和基因分型工具。DNA测序是另一种有效的DNA检测和基因分型技术。特别是随着下一代测序(NGS)技术的出现，诸如Illumina NovaSeq等NGS平台的DNA测序工具越来越多。然而，由于需要昂贵的设备和化学试剂，它们仍然不能像PCR一样用于常规研究，检测和诊断。因此，相比之下，如果克服了引物设计的限制，PCR仍然是最方便、经济高效的DNA检测和基因分型的平台。

Ishino等人于1987年首次在大肠杆菌(E.coli)的基因组中发现了成簇的规律间隔的短回文重复序列，并由Jansen等人在2002年定义为CRISPR(Clustered regularlyinterspaced short palindromic repeat)。CRISPR系统有三种不同类型(I，II和III型)。I型和III型系统需要多种Cas蛋白互相作用才能发挥正常功能，因此要比II型复杂很多。在II型系统中，只需要一种蛋白(Cas9)，Cas9与引导RNA(gRNA)结合后能够特异地识别和切割双链DNA(dsDNA)。Cas9是II型系统的标志蛋白，在反式激活crRNA(tracrRNA)和CRISPR RNA(crRNA)的引导下发挥作用。tracrRNA能够激活Cas9核酸酶，crRNA特异地与靶DNA的20个核苷酸序列互补。因此crRNA决定了CRISPR-Cas9系统的特异性。将tracrRNA和crRNA整合成一个RNA即单导向RNA(sgRNA)后，极大地简化了II型CRISPR系统的应用。Cas9介导的位点特异性切割依赖于sgRNA和PAM(protospacer adjacent motif)。如果目标DNA中有PAM，在sgRNA的引导下，Cas9在PAM上游三个碱基处切割靶DNA。目前，由于简便和高效，CRISPR-Cas9系统已被许多研究者广泛应用于基因组编辑领域。另外,dCas9(dead Cas9)是由Cas9改造而成，其失去了核酸酶活性，但保留基因转录激活结构域(AD)或抑制结构域(ID)，dCas9(deadCas9)作为一种新的人工转录因子已被广泛应用于内源性基因表达调控。