[发明专利]一种基于CRISPR的DNA检测和分型方法及其应用

权利要求书

1.一种非诊断的基于CRISPR的DNA检测和分型方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）用一对通用引物PCR扩增靶DNA；

（2）用Cas9/sgRNA切割扩增后的靶DNA；

（3）用DNA连接酶连接被切割的靶DNA，产生分子内DNA成环或者分子间的平末端DNA连接；

（4）用PCR扩增连接后的靶DNA；

步骤（2）所述Cas9/sgRNA切割扩增后的靶DNA为利用Cas9核酸酶与靶向目的DNA 的一对sgRNA混合，形成两个Cas9/sgRNA复合物；该复合物在sgRNA的引导下靶向目的DNA，使Cas9/sgRNA复合物与目的DNA结合并在Cas9的作用下发生目的DNA的双链切割，步骤（4）所述用PCR扩增连接后的靶DNA为使用一对在靶DNA上呈反向的PCR引物；该对反向的PCR引物在靶DNA未发生Cas9/sgRNA切割和之后步骤（3）的连接时，不能扩增靶DNA，而在靶DNA发生Cas9/sgRNA切割并经步骤（3）连接后，则可扩增靶DNA。

2.根据权利要求1所述的DNA检测和分型方法，其特征在于，步骤（1）所述通用引物为可将含有靶DNA序列的DNA片段从待检测DNA样品中PCR扩增出来的一对引物；该对引物是单一序列或简并序列。

3.根据权利要求1所述的DNA检测和分型方法，其特征在于，步骤（1）和步骤（4）所述PCR包括普通PCR、定量PCR或数字PCR。

4.根据权利要求1所述的DNA检测和分型方法在，其特征在于，所述DNA检测和分型方法在检测高拷贝靶DNA或仅用于含量丰富的靶DNA分型检测时，为通过Cas9/sgRNA直接切割高拷贝靶DNA或含量丰富的靶DNA进行检测。