[发明专利]一种人类游离DNA提取方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人类游离DNA提取方法及其试剂盒。

背景技术

核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两类，是一类带有遗传信息的生物大分子。真核生物的DNA主要以染色体的形式存在于细胞核内，但在人类的外周血中也游离着片段性的游离DNA(Cell-free DNA,cfDNA)，这些游离DNA可以单链或双链DNA的形式存在，大多数游离DNA是以核蛋白形式存在的双链DNA，且片段较小，长度一般在几十或几百个bp之间。

研究发现，游离DNA中含有非常重要的遗传信息。1997年YMD Lo等人在怀有男胎的孕妇外周血中检测到了Y染色体存在，证明了孕妇外周血中存在胎儿游离DNA。目前临床上游离DNA主要运用于父源性DNA检测，如SRY基因型鉴定胎儿性别、检测RhD血型；产前诊断，如21三体等非整倍体疾病检测；以及肿瘤检测等方面。

使用游离的DNA进行检测的第一步就是要对人类血清血浆中的游离DNA进行提取纯化，提取产物的质量直接影响到后续检测结果的准确性和可靠性。而游离DNA的片段小、在血清和血浆中含量低，这无疑给试剂盒提取的得率提出了更高的要求。目前，游离DNA的提取方法主要有酚/仿抽提、吸附柱法和磁珠法。酚/仿抽提法最为经典，但由于操作繁琐而且在提取过程中使用酚和氯仿两种可对操作人员带来伤害的有机溶剂，越来越难以被操作人员接受。吸附柱法是目前主要使用的方法，该方法不需要使用毒性较大的有机溶剂，操作方法较酚/仿抽提操作简单，但很难实验自动化，难以高效率的批量提取样本。

磁珠法是指以超顺磁性氧化硅纳米磁性微球(即磁珠)为载体，通过磁珠在高盐、低PH溶液中吸附核酸，而在低盐溶液中将核酸从磁珠表面脱离的原理进行核酸提取的方法。如中国专利申请CN105112400公开了一种提取游离DNA的试剂盒，其含有磁珠、蛋白酶K、Blinding Buffer，特征是通过一、二次结合，能够提取大于500bp和小于500bp的游离DNA。又如中国专利申请CN105671030A公开了一种基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA提取方法，其特征是在结合液B中加入非极性溶剂，促进核酸分子被纳米磁珠的吸附，提高提取率，同时结合物理强化作用，促使核酸从纳米磁珠上的解吸，增加洗脱效率。

目前公开的基于磁珠提取法的试剂盒均存在一些问题：一是均采用蛋白酶K对样品进行预处理，导致生产成本较高，操作繁琐，对生产或运输、储存条件要求较高；二是，在结合液中使用了较高浓度的异丙醇，而使用异丙醇沉淀容易产生盐类与DNA共沉淀的问题；三是，虽然磁珠在前期与DNA具有较高的结合率，但后期洗脱率较低，导致DNA提取收率难以保证；四是，为了确保核酸的提取纯度，一般在后续漂洗阶段均需要经过多次的漂洗才能完全去除杂质，导致成本的上升。

因此，有必要提供一种成本低廉，核酸提取效率和纯度高，操作简单的游离DNA提取试剂盒。

发明内容

本发明旨在提供一种人类游离DNA提取方法及其试剂盒，与传统试剂盒相比，本发明提供了一种新的裂解液，在样本预处理阶段不加入蛋白酶K，因此可以很好的控制成本；提供了一种新的结合液，一方面不用加入异丙醇，因此无需担心加入异丙醇导致的盐类共沉淀问题，另一方面，意外地，发现新的结合液还能够使后续漂洗次数降至1次，就能够得到较高纯度的核酸，节省了成本；本发明还提供了一种磁珠预处理液，处理磁珠后可以提高后续DNA的洗脱率，提高DNA的得率。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：一种人类游离DNA提取试剂盒，包括磁珠预处理液、细胞裂解液、结合液、漂洗液Ⅰ、漂洗液Ⅱ、核酸洗脱液以及羧基化磁珠，所述结合液包括以下浓度的组分：0.1～0.3mmol/L聚山梨酯80降解物、12～26mmol/L聚乙二醇8000以及1～2mmol/L氯化钠。

进一步地，所述结合液包括以下浓度的组分：0.2mmol/L聚山梨酯80降解物、16mmol/L聚乙二醇8000以及1.5mmol/L氯化钠。

进一步地，所述细胞裂解液为：20～100mmol/L Tris-Hcl、50～200mmol/L NaCl、10～100mmol/L乙二胺四乙酸二钠、1～10mol/L异硫氰酸胍、0.5～3mol/L醋酸钾、0.5％～5wt％曲拉通以及1～10wt％吐温20，PH值为4.0～6.8。