[发明专利]一种人类游离DNA提取方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种人类游离DNA提取试剂盒，其特征在于，包括磁珠预处理液、细胞裂解液、结合液、漂洗液Ⅰ、漂洗液Ⅱ、核酸洗脱液以及羧基化磁珠，所述结合液包括以下浓度的组分：0.1～0.3mmol/L聚山梨酯80降解物、12～26mmol/L聚乙二醇8000以及1～2mmol/L氯化钠。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述细胞裂解液为：20～100mmol/L Tris-Hcl、50～200mmol/L NaCl、10～100mmol/L乙二胺四乙酸二钠、1～10mol/L异硫氰酸胍、0.5～3mol/L醋酸钾、0.5％～5wt％曲拉通以及1～10wt％吐温20，PH值为4.0～6.8。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述漂洗液Ⅰ为：20～200mmol/L Tris-Hcl、50～250mmol/L NaCl、10～100mmol/L乙二胺四乙酸二钠、1～10mol/L盐酸胍、0.5～5wt％曲拉通、1～10wt％吐温20以及异丙醇30wt％，PH值为4.0～6.8。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述漂洗液Ⅱ为：70-80％的乙醇。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸洗脱液为：5～30mmol/L Tris-Hcl和0.2～2mmol/L EDTA，pH为6.5～8.0。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述聚山梨酸酯80降解物由以下步骤制得：

往100ml摇瓶内加入聚山梨酯80溶液，接种2～5wt％浓度为800～1000cfu/mL的绿色木霉，设置温度为30～35℃，转速为120r/min，培养15d，离心，取上清；依次对上清进行微滤、阳离子交换和灭菌，制得聚山梨酯80降解物。

7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁珠预处理液包括非极性氨基酸和低聚果糖，其中所述非极性氨基酸以200～1000ppm的浓度存在。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述非极性氨基酸选自亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸中的一种或两种以上。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述非极性氨基酸由亮氨酸和缬氨酸按1：(0.01～1)的重量比组成。

10.一种利用如上述权利要求书1～9任一所述的试剂盒提取人类游离DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A)将所述羧基化磁珠通过所述磁珠预处理液进行处理，备用；

B)在离心管中加入血浆/血清，细胞裂解液和结合液，上下颠倒混匀，加入上述经预处理后的羧基化磁珠，涡旋混匀，55～65℃水浴5～10min；

C)待冷却至室温，瞬时离心，将离心管置于磁力架上，进行磁珠分离，移去上清，保留磁珠；

D)往离心管中加入漂洗液Ⅰ，涡旋混匀，瞬时离心，将离心管置于磁力架上，进行磁珠分离，轻轻缓慢转动离心管2-3圈，弃去上清；

E)往离心管中加入漂洗液Ⅱ，涡旋混匀，瞬时离心，将离心管置于磁力架上，进行磁珠分离，轻轻缓慢转动离心管2-3圈，弃去上清；

F)将离心管置于磁力架上，晾干5～10min，加入洗脱液，涡旋混匀，使磁珠分散与溶液中，室温静置3～5min；瞬时离心，将离心管置于磁力架上进行磁珠分离，吸取上清液体，此液体即为提取的血浆/血清游离DNA。