[发明专利]一种产琥珀酸放线杆菌基因敲除方法

说明书

本发明公开了一种产琥珀酸放线杆菌基因敲除方法。通过构建目的基因左右同源臂；构建带有抗生素筛选标记及负筛选标记的自杀质粒；将目的基因左右同源臂连接自杀质粒，并转入供体菌感受态细胞中，通过抗性平板涂布筛选正确的阳性单克隆并测序验证；将正确的阳性单克隆转入目的菌株产琥珀酸放线杆菌，在抗性平板中筛选发生单交换的阳性单克隆，将发生正确单交换的阳性单克隆进行负筛选得到缺失目的基因的重组菌株。本发明的方法针对产琥珀酸放线杆菌敲除目的基因，其操作过程简单，转化效率高，适用于多基因敲除，且能够实现目的基因的无痕敲除。

技术领域

本发明涉及基因工程及代谢工程改造领域，具体涉及一种产琥珀酸放线杆菌高效基因敲除方法。

背景技术

琥珀酸(又称丁二酸(Succinic acid))是一种常见的天然有机酸，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。作为一种重要的化工原料，它在医药、食品以及表面活性剂等行业也有着广泛的用途。琥珀酸可作为合成复杂有机化合物的中间体，也可以作为C₄平台化合物用于合成大宗化学品以及生物可降解材料，因此琥珀酸被认为是继柠檬酸后最具市场潜力的发酵有机酸产品。

传统的琥珀酸化学合成法采用丁烷经顺丁烯二酸酐通过电解生产，存在成本高和环境污染等问题，限制了其作为基本化工原料的广泛应用。生物法生产琥珀酸是以可再生碳源(如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等)和CO₂作为主要原料，通过菌株发酵生产琥珀酸，因此新工艺本身不仅摆脱了对石化原料的依赖，而且开辟了对温室气体CO₂利用的新途径。一旦实现了丁二酸发酵的大规模生产，就可以以丁二酸取代一些石油化工产品，而成本的降低更有利于该产品的广泛应用，社会、环境效益更加显著。

目前，琥珀酸工业发酵菌株的研究主要集中在产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)，产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)和大肠杆菌(Escherichiacoli)等。其中在琥珀酸的发酵生产中，产琥珀酸放线杆菌因其具有耐高底物、产物浓度，高产琥珀酸，碳源广泛等优点已成为目前最具产业化生产前景的琥珀酸生产菌株。从自然界筛选获得的野生型菌株在琥珀酸的合成过程中，往往会伴有副产物的生成，因此须采用基因工程及代谢工程技术对产琥珀酸放线杆菌进行代谢工程改造以获得生产性能优良且适用于工业化生产的琥珀酸生产菌株。

发明内容

本发明的目的在于建立一种产琥珀酸放线杆菌高效基因敲除方法，为A.succinogenes属菌株提供高效的遗传操作平台，利用该遗传操作平台对产琥珀酸放线杆菌进行代谢工程改造以获得生产性能优良且适用于工业化生产的琥珀酸生产菌株。

为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案：

一种产琥珀酸放线杆菌基因敲除方法，包括如下步骤：

(1)构建目的基因左右同源臂，并测序验证；

(2)构建带有抗生素筛选标记及负筛选标记的自杀质粒；

(3)将目的基因左右同源臂连接自杀质粒，并转入供体菌感受态细胞中，通过抗性平板涂布筛选正确的阳性单克隆并测序验证；

(4)将正确的阳性单克隆转入目的菌株产琥珀酸放线杆菌，在抗性平板中筛选发生单交换的阳性单克隆，将发生正确单交换的阳性单克隆进行负筛选得到缺失目的基因的重组菌株。

本发明的方法，所述步骤(1)中，同源左臂和同源右臂片段大小为1500bp-2000bp。优选通过融合PCR的方式构建目的基因左右同源臂。在琥珀酸放线杆菌中如果要进行基因敲除，同源左臂及同源右臂的片段大小选择1500-2000bp的范围之中，可提高基因敲除效率。