[发明专利]一种产琥珀酸放线杆菌基因敲除方法有效
| 申请号： | 201711156168.1 | 申请日： | 2017-11-20 |
| 公开（公告）号： | CN107916247B | 公开（公告）日： | 2020-12-08 |
| 发明（设计）人： | 姜岷;朱君如;信丰学;章文明;董维亮;马江锋 | 申请（专利权）人： | 南京工业大学 |
| 主分类号： | C12N1/21 | 分类号： | C12N1/21;C12N15/74;C12N15/65;C12R1/01 |
| 代理公司： | 江苏致邦律师事务所 32230 | 代理人： | 徐蓓;尹妍 |
| 地址： | 211816 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 琥珀酸 放线 杆菌 基因 方法 | ||
【权利要求书】：
1.一种产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)基因敲除方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建目的基因左右同源臂，并测序验证；同源左臂和同源右臂片段大小为1500bp-2000bp；
(2)构建带有氯霉素抗性基因Cat、蔗糖负筛选标记基因SacB的自杀质粒pJC4；
(3)将目的基因左右同源臂通过一步克隆的方式连接自杀质粒pJC4的SacⅠ酶切位点，并转入供体菌感受态细胞中，通过氯霉素抗性平板涂布筛选正确的阳性单克隆并测序验证，氯霉素筛选浓度为25ug/mL；
(4)将正确的阳性单克隆转入目的菌株产琥珀酸放线杆菌，在氯霉素抗性平板中筛选发生单交换的阳性单克隆，氯霉素筛选浓度为5ug/mL，将发生正确单交换的阳性单克隆涂布在蔗糖平板进行负筛选得到缺失目的基因的重组菌株，蔗糖浓度为平板体积的10％。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，通过融合PCR的方式构建目的基因左右同源臂。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，通过接合转移的方式将正确的阳性单克隆转入目的菌株产琥珀酸放线杆菌。
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