[发明专利]一种基于碳点标记的荧光免疫吸附测定超痕量油胺枝接聚琥珀酰亚胺的方法

权利要求书

1.一种基于碳点标记的荧光免疫吸附测定超痕量油胺枝接聚琥珀酰亚胺的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

a、制备PSI_OAm包被抗原和PSI_OAm免疫原；

b、制备抗PSI_OAm抗体；

c、制备氨基功能化荧光碳点C-dots；

d、制备碳点标记的抗PSI_OAm抗体；

e、将油胺枝接聚琥珀酰亚胺(PSI_OAm)包被抗原经包被液稀释后包被于96孔板中，封闭、加入不同浓度的PSI_OAm标准品，以碳点标记的PSI_OAm抗体作为一抗，建立直接竞争荧光免疫分析定量检测PSI_OAm；

f、以PSI_OAm标准液浓度的对数为横坐标，吸光度值为纵坐标建立标准曲线，从而定量检测出PSI_OAm的浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准曲线的线性方程为F＝13955.82-981.93lgC，其中F为荧光强度值，C为PSI_OAm浓度；其相关系数R＝-0.997，线性范围为5×10^-4～5×10²ng/mL，检出限为0.15pg/mL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤c具体包括以下步骤：将无水柠檬酸和乙二胺溶解在超纯水中，180℃水热反应4-5小时，所得产物经纯化后即可得到所述氨基功能化碳点C-dots。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述无水柠檬酸的质量与乙二胺的体积之比为0.42g：530μL。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤d具体包括以下步骤：

d-1、向C-dots溶液中加入质量浓度为25％的戊二醛，两者的体积之比为9～15：1，室温搅拌1h，以超纯水为透析液用100～500Da的透析袋进行透析；

d-2、向步骤d-1中加入与透析后的溶液等体积的抗PSI_OAm抗体溶液，搅拌反应1h，然后加入浓度20mg/mL的新制的硼氢化钠溶液，于4℃冰箱中过夜；

d-3、将步骤d-2得到的溶液以去离子水为透析液，用25000～30000Da的透析袋透析纯化，得到碳点标记的PSI_OAm抗体。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述C-dots溶液的浓度为162mg/mL，是将C-dots溶于10mM，pH＝9.6的碳酸盐缓冲液中制备得到的。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述抗PSI_OAm抗体溶液的制备方法为：经抗PSI_OAm抗体，用pH＝7.4的磷酸盐缓冲液稀释至每毫升内含抗体2～3mg。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述硼氢化钠溶液与C-dots溶液的体积之比为1:2～4。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤e具体包括以下步骤：

e-1、用包被缓冲液将PSI_OAm包被抗原稀释60倍，包被96孔板中，每孔100μL，4℃冰箱过夜；

e-2、封闭：PBST溶液洗涤3次，甩干，每次3～5min，洗去未结合的PSI_OAm包被抗原,加入1wt％酪蛋白，每孔200μL进行封闭，37℃烘箱温育1～2h；

e-3、加样竞争：PBST溶液洗涤3次，甩干，每次3～5min，洗去多余的封闭液,然后将50μL碳点标记的PSI_OAm抗体和50μL不同浓度的PSI_OAm标准品分梯度加入各孔中，使之发生竞争反应，37℃烘箱温育1～2h；

e-4、检测：PBST溶液洗涤3次，甩干，每次3～5min，除去游离态的PSI_OAm标准品或抗体结合物,用多功能酶标仪测定各孔在激发波长为360nm，发射波长为475nm处的荧光强度值。

10.根据权利要求1或9所述的方法，其特征在于，所述PSI_OAm包被抗原的浓度为1～3mg/mL。