[发明专利]一种从猪血中提取凝血酶的方法

说明书

本发明公开了一种从猪血中提取凝血酶的方法，涉及凝血酶生产技术领域，包括如下几个步骤：对猪血进行离心收集上清抗凝血浆，利用DEAE sepharose A‑50吸附上清抗凝血浆中的凝血酶原，氯化钠溶液Ⅰ对凝血酶原进行洗涤后，用氯化钠‑氯化钙混合溶液洗脱并激活凝血酶原，得到的流出液即为凝血酶粗提液，再用724离子交换树脂纯化，收集凝血酶活性峰处的凝血酶精提液，对凝血酶精提液去除病毒后脱盐浓缩，最后冻干得到凝血酶成品，本发明加快了凝血酶原的活化效率，简化了制备工艺。

技术领域

本发明涉及凝血酶生产技术领域，特别涉及一种从猪血中提取凝血酶的方法。

背景技术

凝血酶是机体凝血系统中的天然组分，由前体凝血酶原经凝血酶原激活物激活而成。凝血酶由两条肽链组成，肽链件以二硫键相连，是一种具有高特异性的丝氨酸蛋白酶。凝血酶能水解纤维蛋白原上的4个Arg-Gly肽键，使纤维蛋白原变成不溶性的纤维蛋白，从而使血液凝固。目前国内外主要从动物血浆和人血浆中制备，国内的养猪业规模大，区域广，猪血资源较为丰富，并且凝血酶在临床上应用广泛，从猪血中提取凝血酶，不仅有效利用了猪血资源，也解决因猪血废弃造成的环污染问题。

申请公布号为CN105624134A的中国发明专利公开了一种限制性凝血酶的制备方法，利用阴离子交换层析介质从猪血浆中吸附凝血酶原，对阴离子层析柱进行洗脱，活化凝血酶原，得凝血酶粗溶液，经超滤浓缩，得凝血酶浓缩液，再用阳离子交换层析介质吸附凝血酶，对阳离子层析柱进行洗脱，得凝血酶溶液，经超滤脱盐浓缩，最后冻干得限制性凝血酶成品。

上述制备方法在实际操作过程中，使用柠檬酸三钠作为猪血中提取凝血酶的洗脱剂，而柠檬酸三钠可与钙离子螯合，形成难以解离的可溶性柠檬酸盐复合物，使得钙离子减少，阻止凝血酶原转化成凝血酶，进而在后期需补充足量的钙离子，而后期加入的钙离子通常先与柠檬酸三钠螯合，待柠檬酸三钠被完全螯合后剩余的钙离子再促进凝血酶原转化成凝血酶，进而降低了凝血酶原被激活的效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种从猪血中提取凝血酶的方法，使得凝血酶原的洗脱和激活同步进行，加快了凝血酶原被激活的效率。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种从猪血中提取凝血酶的方法，包括如下步骤：

(1)往猪血中加入柠檬酸三钠溶液，将混合液离心至分层后收集上清液，上清液用双层脱脂纱布过滤后得上清抗凝血浆；

(2)将步骤(1)所得的上清抗凝血浆用A-50层析柱进行层析，上清抗凝血浆中的凝血酶原被吸附于A-50层析柱上，用氯化钠溶液Ⅰ洗涤A-50层析柱，随后用氯化钠-氯化钙混合溶液洗脱并激活吸附于A-50层析柱上的凝血酶，得到凝血酶粗提液；

(3)将步骤(2)所得的凝血酶粗提液用树脂层析柱进行层析，凝血酶粗提液中的凝血酶被吸附于树脂层析柱上，用氯化钠溶液Ⅱ洗脱吸附于树脂层析柱上的凝血酶，得到凝血酶精提液；

(4)将步骤(3)所得的凝血酶精提液去除病毒后进行脱盐浓缩，得凝血酶浓缩液；

(5)将步骤(4)所得的凝血酶浓缩液冻干，即得白色的粉状凝血酶成品。