[发明专利]一种从猪血中提取凝血酶的方法

权利要求书

1.一种从猪血中提取凝血酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）往猪血中加入柠檬酸三钠溶液，加入猪血中的柠檬酸三钠溶液的用量为每1L猪血加入7.0-8.0mL的柠檬酸三钠溶液，将混合液离心至分层后收集上清液，上清液用双层脱脂纱布过滤后得上清抗凝血浆；

（2）将步骤（1）所得的上清抗凝血浆用 A-50层析柱进行层析，上清抗凝血浆中的凝血酶原被吸附于A-50层析柱上，用浓度为0.1-0.3M/L的氯化钠溶液Ⅰ洗涤A-50层析柱两次，随后用氯化钠-氯化钙混合溶液洗脱并激活吸附于A-50层析柱上的凝血酶原，得到凝血酶粗提液；

洗涤过程分两次进行，每次洗涤时氯化钠溶液Ⅰ的用量为每1L上清抗凝血浆加入24-26mL的氯化钠溶液Ⅰ；

洗脱并激活凝血酶原的氯化钠-氯化钙混合溶液的氯化钠的浓度为1.5-2.5M/L，氯化钙的浓度为1.0-2.0M/L；

洗脱并激活凝血酶原的氯化钠-氯化钙混合溶液的用量为每100mL上清抗凝血浆加入18mL-20mL的氯化钠-氯化钙混合溶液；

洗脱并激活的操作分两次进行，每次洗脱并激活的操作得到相应的流出液，两次流出液的总和为凝血酶粗提液；

（3）将步骤（2）所得的凝血酶粗提液用树脂层析柱进行层析，凝血酶粗提液中的凝血酶被吸附于树脂层析柱上，用浓度为2.0-3.0g/L的氯化钠溶液Ⅱ洗脱吸附于树脂层析柱上的凝血酶，得到凝血酶精提液；

（4）将步骤（3）所得的凝血酶精提液去除病毒后进行脱盐浓缩，得凝血酶浓缩液；

（5）将步骤（4）所得的凝血酶浓缩液冻干，即得白色的粉状凝血酶成品。

2.根据权利要求1所述的一种从猪血中提取凝血酶的方法，其特征在于：

步骤（1）中加入猪血中的柠檬酸三钠溶液的用量为每1L猪血加入7.5mL的柠檬酸三钠溶液；

步骤（2）中洗涤A-50层析柱的氯化钠溶液Ⅰ的浓度为0.2M/L；

步骤（2）中洗脱并激活凝血酶原的氯化钠-氯化钙混合溶液的氯化钠的浓度为2.0M/L，

氯化钙的浓度为1.5M/L；

步骤（3）中洗脱凝血酶的氯化钠溶液Ⅱ的浓度为2.5g/L。

3.根据权利要求1所述的一种从猪血中提取凝血酶的方法，其特征在于：步骤（2）中的洗涤的过程分两次进行，每次洗涤时氯化钠溶液Ⅰ的用量为每1L上清抗凝血浆加入25mL的氯化钠溶液Ⅰ。

4.根据权利要求1所述的一种从猪血中提取凝血酶的方法，其特征在于：步骤（2）中洗脱并激活凝血酶原的氯化钠-氯化钙混合溶液的用量为每100mL上清抗凝血浆加入19mL的氯化钠-氯化钙混合溶液。

5.根据权利要求1所述的一种从猪血中提取凝血酶的方法，其特征在于：步骤（4）中的凝血酶精提液用孔径为20nm的滤膜去除病毒。