[发明专利]一种组织工程化心肌补片及其制备和应用

说明书

本发明涉及一种组织工程化心肌补片，其特征在于此心肌补片由多种天然高分子材料制备的基底膜以及基底膜上的多层细胞所构成，具有与心肌组织相似的组成、结构及功能。本发明还提供上述组织工程化心肌补片的制备方法。本发明操作简单，成本低，所制备的组织工程化心肌补片生物活性高，强度好，可贴附在心脏受损部位，促进受损心肌组织的修复。本发明克服了已有技术的缺陷，在再生医学领域中将发挥重要作用。

技术领域

本发明涉及再生医学领域，特别涉及一种组织工程化心肌补片及其制备和应用。

背景技术

现有的溶栓药物与介入手术疗法尽管可以改善心肌梗死患者的症状，但却无法逆转坏死心肌。对于严重的心肌梗死患者，器官移植是根本治疗手段，但由于移植供体的缺乏与免疫排斥问题，严重限制了器官移植的开展。尽管一些临床研究证实常规细胞注射方法能够改善患者心功能，但是存在细胞存留量少、细胞活率低以及心律失常等问题。心肌补片是通过组织工程手段制备的片状的工程化心脏组织，它具有细胞片层结构，能够提高植入后细胞的存留量和存活率，因此越来越受到重视。不同的构建方法可以制备不同特点的心肌补片，其功能和特性也各不相同，对治疗效果有很大影响。目前研究比较广泛的是日本Teruo Okano团队发明的无载体细胞片层制备方法，即利用温敏材料聚异丙基丙烯酰胺在37℃呈疏水性，在20℃时材料转变为亲水性这一原理，将温敏材料铺在培养皿底部并在其上种植种子细胞，细胞经一段时间培养并建立好细胞间连接后，通过降低温度(20℃)使得细胞片逐渐与培养皿底部分离。然而他们所制备的细胞片层是依靠细胞之间的连接构成的，培养时间长，且细胞层厚度受限，力学强度低，因此移植前的培养时间较长，移植时细胞片层缺乏支撑，操作困难。与无载体细胞片层相比，有载体细胞片层是使用支架材料作为补片的基底层，一方面可显著提高细胞片层的厚度和力学强度，增加移植手术的可操作性，另一方面支架材料的特性可以影响心肌组织微环境及细胞片层的活性和功能。目前心肌补片基底层主要包括聚丙烯晴、聚己内酯等人造高分子基底层，以及胶原、壳聚糖、蚕丝蛋白等一种或两种天然高分子所构建的基底层，其成分、结构及功能与体内细胞外基质差距很大，缺乏足够的生物活性。另外，目前复合有单细胞层的心肌补片已经得到了应用，取得了广泛认可，但是单细胞层尚未形成微组织，缺乏足够的生物学功能，治疗效果还是很有限。

为了改善现有心肌补片基底层与体内细胞外基质相差较大以及单细胞层生物功能受限的问题，本发明提出了一种新型的组织工程化心肌补片及其制备方法。本发明提出的心肌补片由仿细胞外基质的基底膜以及基底膜上的多层细胞构成，是与体内心肌组织更加相似的微型心肌组织，具有更高的生物学活性和更好的力学强度，且植入操作更方便，能够显著提高治疗效果。因此，本发明克服了已有技术的缺陷，在心肌修复领域中将发挥重要作用。

发明内容

本发明公开了一种组织工程化心肌补片，此心肌补片由多种天然高分子材料制备的基底膜以及基底膜上的多层细胞所构成；

所述天然高分子材料为分子量为5000-300000kDa的壳聚糖、分子量为1000000-4000000kDa的透明质酸或胶冻强度为大于100Bloom g的明胶中的一种或两种以上，所述多层细胞为心肌细胞、成肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞的一种或两种以上，所述细胞包括干细胞向心肌细胞诱导分化获得的细胞。此心肌补片由多种天然高分子材料制备的基底膜以及基底膜上的多层细胞所构成，具有与心肌组织相似的组成、结构及功能。

本发明的组织工程化心肌补片通过以下具体技术方案予以制备：(1)制备含有壳聚糖、透明质酸及明胶的成胶水溶液，之后加入交联剂进行交联反应，获得凝胶膜，再经过中和、清洗及干燥后即得到基底膜；(2)在基底膜上接种细胞并培养，形成第一层细胞层；(3)在第一层细胞层之上加入细胞粘附剂，之后接种细胞并培养，形成第二层细胞层；(4)在第二层细胞层上再加入细胞粘附剂，接种细胞并培养，形成第三层细胞层；(5)以此类推，可制备具有1-10层细胞层的心肌补片。

所述壳聚糖的分子量为5000-300000kDa，其在成胶水溶液中的浓度为1-10％(w/v,g/ml)；