[发明专利]一种组织工程化心肌补片及其制备和应用

权利要求书

1.一种组织工程化心肌补片，其特征在于：此心肌补片由多种天然高分子材料制备的基底膜以及基底膜上的多层细胞所构成；

所述天然高分子材料为分子量为5000-300000 kDa的壳聚糖、分子量为1000000-4000000 kDa的透明质酸或胶冻强度为大于100 Bloom g的明胶中的两种以上，所述多层细胞为心肌细胞、成肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞的一种或两种以上，所述细胞包括干细胞向心肌细胞诱导分化获得的细胞。

2.根据权利要求1所述的一种组织工程化心肌补片的制备方法，其制备步骤为：

（1）制备含有壳聚糖、透明质酸或明胶中两种以上的成胶水溶液，之后加入交联剂进行交联反应，获得凝胶膜，再经过中和、清洗及干燥后即得到基底膜；

（2）在基底膜上接种细胞并培养，形成第一层细胞层；

（3）在第一层细胞层之上加入细胞粘附剂，之后接种细胞并培养，形成第二层细胞层；

（4）在第二层细胞层上再加入细胞粘附剂，接种细胞并培养，形成第三层细胞层；

（5）以此类推重复制备细胞层，可制备具有1-10层细胞层的心肌补片。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述壳聚糖的分子量为5000-300000 kDa，其在成胶水溶液中的浓度为1-10%g/ml；

所述透明质酸的分子量为1000000-4000000 kDa，其在成胶水溶液中的浓度为0.1-1%g/ml；

所述明胶包括碱性明胶、酸性明胶的一种或两种混合；

所述明胶的胶冻强度为大于100 Bloom g，其在成胶水溶液中的浓度为3-15% g/ml；

所述交联剂为甲醛、戊二醛、京尼平或碳二亚胺的一种或两种以上；

所述交联剂与成胶水溶液混合后的交联剂浓度为0.01-3% g/ml；

所述交联条件为温度18-25℃，湿度50-80%。

4.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述中和过程为使用浓度0.03~0.5M的甘氨酸溶液浸泡交联形成的凝胶膜，浸泡时间为：1~4h。

5.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述干燥的条件为温度18-25℃，湿度20%。

6.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述基底膜包括壳聚糖、透明质酸、明胶及交联剂，其各自质量百分比w/w为2.2-62.1%、0.2-6.2%、6.6-93%及0.02-18.6%。

7.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述细胞包括心肌细胞、成肌细胞、内皮细胞或成纤维细胞的一种或两种以上；

所述细胞包括干细胞向心肌细胞诱导分化获得的细胞。

8.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述细胞粘附剂包括纤维蛋白、胶原、多聚赖氨酸、壳聚糖衍生物或Matrigel中的一种或两种以上；

所述细胞粘附剂的浓度g/ml为纤维蛋白1-3%,胶原3-8%、多聚赖氨酸1-4%、壳聚糖衍生物1-3% 、Matrigel 3-10%；

细胞粘附剂的用量为100~500微升/cm²。